趙峰 李碧英 張其文 符偉 張恩華

摘要[目的]提取女貞不同種質(zhì)材料的基因組DNA，并篩選RAPD引物。[方法]采用改良CTAB法提取女貞基因組DNA，并以此種方法提取的女貞基因組DNA為模板，對(duì)RAPD引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選有效引物。[結(jié)果]篩選出21個(gè)多態(tài)性豐富、條帶清晰且重復(fù)性好的有效引物，經(jīng)檢測(cè)所獲得的基因組DNA條帶清晰，且OD260/OD280在1.8左右。用篩選出的21個(gè)有效引物對(duì)126份女貞種質(zhì)材料進(jìn)行RAPDPCR擴(kuò)增，均可獲得帶型豐富且清晰可辨的DNA 指紋圖譜。[結(jié)論]該方法為快速和準(zhǔn)確地應(yīng)用RAPD方法分析女貞種質(zhì)材料的遺傳多樣性提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞女貞（Ligustrum lucidum Ait.）；改良CTAB法；RAPD 標(biāo)記；引物篩選

中圖分類(lèi)號(hào)Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00024-05

基金項(xiàng)目海南省教育廳基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：Hjkj201251）。

作者簡(jiǎn)介趙峰（1981-），女，山東章丘人，講師，碩士，從事農(nóng)學(xué)研究，Email：928662418@ qq.com。*通訊作者，講師，Email：404281096@qq.com。

收稿日期20131209女貞（Ligustrum lucidum Ait.）是木犀科（Oleaceae）女貞屬（Ligustrum）常綠灌木或小喬木植物，其果實(shí)、種子、樹(shù)皮、葉和根均可入藥，且毒性較低[1]。女貞苦丁茶作為代茶飲料植物，性味涼、苦后回甘，具有生津止渴、抗腫瘤、護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、延緩衰老、抗炎、降血脂和降血糖等多種保健作用[2-4]。女貞子（FRUCTUS LIGUSTRI LUCIDI）中主要含有三萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類(lèi)及多糖、氨基酸、脂肪酸、揮發(fā)油、色素、礦物質(zhì)等多種化學(xué)成分[5]。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA）是由Williams和Welsh在1990年各自獨(dú)立發(fā)現(xiàn)的一種DNA多態(tài)檢測(cè)技術(shù)[6-7]。該方法具有操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的檢測(cè)、種質(zhì)與品種鑒定、種間關(guān)系確定和種下劃分等分類(lèi)學(xué)問(wèn)題的研究[8-15] 。有效提取基因組DNA和尋找適宜的RAPD引物是探討女貞種質(zhì)資源不同居群間的親緣關(guān)系及遺傳多樣性的關(guān)鍵因素。筆者提取女貞不同種質(zhì)材料的基因組DNA，并篩選RAPD引物，以期為快速和準(zhǔn)確地應(yīng)用RAPD方法分析女貞種質(zhì)材料的遺傳多樣性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料分別從海南大學(xué)苦丁茶種質(zhì)資源庫(kù)所定植的來(lái)自不同地域的126份女貞種質(zhì)材料中，取其嫩芽作為試驗(yàn)的供試材料；各份種質(zhì)材料的編號(hào)和原產(chǎn)地如表1所示。

材料編號(hào)原產(chǎn)地材料編號(hào)原產(chǎn)地NZ017貴州省湄潭縣城NZ082湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ018貴州省湄潭縣NZ083湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ019貴州省湄潭縣NZ084湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ020貴州省湄潭縣NZ086湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ021貴州省湄潭縣NZ087湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ022貴州省湄潭縣NZ088湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ023貴州省臺(tái)江縣城NZ089湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ024貴州省臺(tái)江縣城NZ090湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ025貴州省臺(tái)江縣城NZ091湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ026貴州省臺(tái)江縣城NZ092湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ028云南省西疇縣法斗鄉(xiāng)NZ093湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ029江西省南昌市NZ094湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ030湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ095湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ031湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ096湖南省祁東縣步云橋鄉(xiāng)雙江村對(duì)塘組NZ032湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ097南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ033湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ098南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ034湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ099南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ035湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ100南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ036湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ101南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ037湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ102南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ038湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ104南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ039湖南省祁東縣步云橋鎮(zhèn)雙江村對(duì)塘組NZ105南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ041湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)排山村站沖組NZ106南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ042湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)排山村站沖組NZ107南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ043湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)排山村站沖組NZ110南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ044湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)排山村站沖組NZ111南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ045湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)排山村站沖組NZ112南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ046湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ113南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ047湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ114南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ048湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ115南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ049湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ116南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ050湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ117南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ051湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ118南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ052湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ119南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ053湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ120南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ054湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ121南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ055湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ122南京農(nóng)業(yè)大學(xué)校園NZ056湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ123四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ057湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ124四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ058湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ125四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ059湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ126四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ060湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ127四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ061湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ128四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ062湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ130四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ063湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ131四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ064湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ132四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ065湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ133四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ066湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ134四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ067湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ135四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組NZ068湖南省祁東縣白鶴鋪鎮(zhèn)高原村高原組NZ136四川省巴中市平梁鄉(xiāng)北巖村五組

1.2方法

1.2.1基因組DNA 提取。用改良CTAB法提取基因組DNA[16]，僅降低提取液和琉基乙醇的濃度，即3×CTAB變?yōu)?×CTAB，硫基乙醇濃度2.7%。所提取的基因組DNA用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD值，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取DNA的完整性；最后將樣品釋稀成20 ng/μl，用于RAPD反應(yīng)體系的引物篩選。

1.2.2RAPD引物篩選。根據(jù)所購(gòu)引物的理論退火溫度，在此理論退火溫度范圍內(nèi)對(duì)75個(gè)引物設(shè)計(jì)2個(gè)溫度梯度；即38和39 ℃，在94 ℃預(yù)變性4 min，然后按94 ℃變性30 s，退火45 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

取擴(kuò)增產(chǎn)物8和2 μl上樣緩沖液（含40%蔗糖和0.25%溴酚藍(lán)）混勻，點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/ml EB）的上樣孔中，以100 bp的DNA ladder作為對(duì)照分子量標(biāo)準(zhǔn)，在0.5×TBE緩沖液中電壓5 V/cm電泳2.0 h，然后在UVP型凝膠成像系統(tǒng)下照相并記錄，檢驗(yàn)并分析引物篩選結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1基因組DNA提取及檢測(cè)

2.1.1基因組DNA提取。用改良后的CTAB法提取126份女貞苦丁茶種質(zhì)材料的基因組DNA，經(jīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD值（見(jiàn)表2）。結(jié)果顯示，其OD260/OD280均在1.80左右，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖1～2），DNA片段條帶清晰，無(wú)彌散現(xiàn)象。

2.1.2基因組DNA的RAPD擴(kuò)增結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明，所設(shè)對(duì)照中沒(méi)有擴(kuò)增出條帶（圖2中泳道1）；當(dāng)模板濃度在10～320 ng范圍內(nèi)，所擴(kuò)增出的帶型基本一致（圖2中泳道2～8）。另外，用S60號(hào)引物對(duì)126份種質(zhì)材料進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，均能獲得條帶清晰，穩(wěn)定且豐富的條帶（圖3～4）。由此可見(jiàn)，試驗(yàn)中所采用的DNA提取方法是切實(shí)可行的。

3結(jié)論

作者參考李娟玲等的方法和步驟[16]，適當(dāng)降低CTAB（即用2×CTAB替換3×CTAB）和巰基乙醇的用量（巰基乙醇2.7%），提取女貞不同種質(zhì)材料的基因組DNA，并篩選RAPD引物，結(jié)果表明，女貞總DNA的OD值均在1.7～1.9，濃度在231.8～2 553.1 μg/ml。用這種方法提取的基因組DNA為模板，成功篩選出了21個(gè)適合女貞RAPD標(biāo)記的有效引物，分別用這21個(gè)有效引物對(duì)126份女貞種質(zhì)材料擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定且豐富的條帶。

綜上所述，用改良的方法提取女貞屬基因組DNA，能有效排除三萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類(lèi)及多糖等類(lèi)化合物的干擾。篩選出來(lái)的有效引物特異性強(qiáng)，為RAPD標(biāo)記快速、準(zhǔn)確地分析女貞不同居群中種質(zhì)材料的遺傳多樣性以及各居群種質(zhì)材料之間的親緣關(guān)系，種質(zhì)材料的分類(lèi)以及雜交育種等方面的研究提供了分子生物學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2005年版一部）[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：31.

[2] 劉國(guó)民.中國(guó)木犀科代茶植物的多樣性與開(kāi)發(fā)狀況[J].貴州科學(xué)，2003，21（1/2）：69-77.