劉暢 曲英敏 李景梅

摘要[目的]研究人參水提物對VERO細胞在體外培養(yǎng)中的氧化損傷。[方法]采用細胞體外培養(yǎng)技術(shù)、MTT比色法、SOD和MDA試劑盒法、原子力顯微鏡（AFM）觀察法，研究人參水提物對VERO細胞氧化損傷的機制。[結(jié)果]人參水提物對VERO細胞能夠起到明顯的增殖抑制作用。人參水提物對VERO細胞具有一定的的氧化損傷作用且有一定的劑量及時間依賴性。原子力顯微掃描成像結(jié)果表明正常生長的VERO細胞表面光滑、細胞體積飽滿，而人參水提物處理組細胞膜損壞現(xiàn)象明顯，細胞表面的粗糙度較大。[結(jié)論]人參水提物對VERO細胞具有一定的氧化損傷作用，其作用機制可能與細胞膜的損傷有關(guān)。

關(guān)鍵詞人參水提物；VERO細胞；原子力顯微成像；氧化損傷

中圖分類號TQ028.0文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）01-00113-04

基金項目吉林省科技廳項目（201215136）。

作者簡介劉暢（1987-），女，吉林長春人，碩士研究生，研究方向：生物材料，Email：165652403@qq.com。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事生物材料研究，Email：ljm3023@126.com。

收稿日期20131210人參是我國的一種傳統(tǒng)中藥[1]，但關(guān)于其毒性的報道較少。研究表明，人參水溶性蛋白對VERO細胞的體外增殖具有一定的抑制作用[2]。VERO細胞來源于非洲綠猴腎，具有無限增殖的特點，常用于藥物對腎臟毒性影響的試驗[3]。唐蕊華等[4]通過原子力顯微鏡（AFM）對細胞表面掃描成像手段觀察Vero-E6細胞在被漢坦病毒感染前后細胞表面形貌的變化，結(jié)果表明使用AFM掃描經(jīng)不同稀釋度的漢坦病毒處理的細胞表面，發(fā)現(xiàn)細胞表面粗糙程度、細胞表面的空洞數(shù)量均發(fā)生一定的改變，采用AFM技術(shù)可以通過觀察細胞表面超微結(jié)構(gòu)的變化粗略判斷出病毒感染細胞的動態(tài)過程。筆者采用傳統(tǒng)的中藥煎煮法制備人參水提物，以非洲綠猴腎細胞作為人參水提物的受試細胞，探討人參水提物對腎細胞的毒性。

1材料與方法

1.1材料與儀器 1640培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，杭州四季青公司）、胰酶（Trypsin，長春天佳公司）；噻唑蘭（MTT，Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）、鮮人參（購于吉林農(nóng)業(yè)大學，產(chǎn)地為吉林省撫松地區(qū)）、SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所）、MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所）、CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）、原子力顯微鏡（N9410S，Agilent）。

1.2提取物的制備取鮮人參根50 g，剪碎，加入700 ml蒸餾水，100 ℃條件下提取4 h，紗布過濾。濾渣重復提取2次，每次4 h。將3次所得濾液合并，60 ℃水浴濃縮至50 ml，離心（4 500 r/min，15 min），棄去沉淀。得到的上清即為人參水提物（WEG）。將WEG置于60 ℃水浴繼續(xù)濃縮，冷凍干燥后用少量無菌培養(yǎng)液將其溶解，原始濃度為200 mg/ml，用0.22 μm濾膜過濾除菌。用培養(yǎng)液稀釋成所需要的濃度。

1.3體外試驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及傳代。將VERO細胞用含10%滅活胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液按照1×105個/ml的濃度接種于無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)。0.25%胰酶消化液消化傳代，3～4 d傳代1次。試驗所用VERO細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.2MTT法檢測WEG對VERO細胞的影響。 將VERO細胞用含8%滅活胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)液按照1×105個/ml的濃度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2（95%空氣）培養(yǎng)箱內(nèi)。0.25%胰酶消化傳代，3～4 d傳代1次。試驗所用VERO細胞均處于對數(shù)生長期。

采用MTT比色法檢測人參水提物（WEG）對VERO細胞的增殖抑制作用。收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至105個/ml，取若干塊無菌96孔細胞培養(yǎng)板，使每孔加入100 μl含有上述懸浮細胞的培養(yǎng)液，靜置，移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液。加入不同濃度的人參提取液，用培養(yǎng)液補足至200 μl，使每孔中藥物的終濃度為20、40、60、80、100 mg/ml，對照組加入空白培養(yǎng)液。每組設(shè)6個復孔。將培養(yǎng)板置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2（95%空氣）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，每12 h取出一塊培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。每組試驗重復3次。在酶標儀上以空白孔為對照調(diào)零，在波長490 nm處測定各孔的吸光度值，計算細胞增殖抑制率，計算IC50值，以時間、濃度為橫軸，以光吸收值（A）、增殖抑制率為縱軸，繪制相應(yīng)曲線。

抑制率=（1-A490加提取液組細胞吸光值/A490對照組細胞吸光值）×100%

1.3.3WEG對VERO細胞氧化損傷的影響。按照SOD試劑盒、MDA試劑盒說明書中的方法，對不同濃度WEG處理24 h的VERO進行SOD活性、MDA含量的檢測。每組試驗重復3次。

1.3.4VERO細胞的AFM探測。將經(jīng)75%乙醇溶液浸泡消毒的蓋玻片置于無菌6孔板細胞培養(yǎng)板中，接種對數(shù)生長期的VERO細胞，調(diào)節(jié)細胞密度105～106個/ml，每孔2 ml。培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)基并加入WEG，使每孔藥物的終濃度為20、40、60、80、100 mg/ml，對照組加入空白培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，棄掉培養(yǎng)基，加入無菌PBS輕輕沖洗每孔。棄掉PBS，每孔加入2.5%戊二醛固定細胞15 min。棄掉戊二醛，用超純水洗滌蓋玻片3次。將制備好的樣品置于原子力顯微鏡的XY掃描臺上，用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域，輕敲模式成像。試驗采用100 μm掃描器，標準硅探針，微懸臂的彈性系數(shù)為40 N/m，共振頻率為300 kHz，獲得圖像像素為512×512。AFM圖像以自帶軟件Pico Image Basic 6.2處理。每組試驗重復3次。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間數(shù)據(jù)采用獨立樣本t檢驗法進行兩兩比較分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，P<0.05表示差異顯著。MTT中的抑制率曲線采用Origin 8.0軟件進行分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度人參水提物對VERO細胞體外增殖的影響不同濃度的人參水提物（WEG）均對VERO細胞起到不同程度的增殖抑制作用。從圖1可以看出，隨著WEG濃度的增加，試驗組VERO細胞存活數(shù)量明顯降低。

2.4WEG對VERO細胞氧化損傷的影響由表1可知，與對照組相比，各濃度WEG組的SOD活性呈明顯低于對照組，各組MDA含量明顯高于對照組（P<0.05）。隨著WEG濃度的升高，各組SOD活性相應(yīng)降低，各組MDA含量對應(yīng)性升高。這說明人參水提物對VERO細胞的正常生長起到了破壞作用，使細胞受到損傷。

2.5原子力顯微鏡對VERO細胞的觀測結(jié)果基于原子力顯微鏡在納米尺度上的觀測技術(shù)對VERO細胞進行細胞結(jié)構(gòu)上的探測，希望能夠從WEG對VERO細胞結(jié)構(gòu)上的影響來探討WEG對VERO細胞體外增殖的抑制作用。取經(jīng)20、40、60、80和100 mg/ml WEG培養(yǎng)2 d的VERO細胞，每組至少用AFM掃描成像10個細胞，獲得掃描范圍為80 μm×80 μm的VERO細胞及表面超微結(jié)構(gòu)圖（圖4）。

3討論

中草藥被認為毒副作用小、使用安全，但仍有許多因用藥不當而引發(fā)不良反應(yīng)的報道[5]。人參的主要活性成分是人參皂苷和人參多糖，其中關(guān)于人參皂苷的研究主要集中于改善機體免疫力、對心腦血管的保護作用、抗腫瘤作用等[6]，且研究大多局限于動物試驗，其應(yīng)用于臨床實踐的藥理作用仍需大量研究。據(jù)報道，當將一定濃度的人參提取物添加到新生大鼠心肌培養(yǎng)基中時，新生大鼠心肌細胞出現(xiàn)跳動異常的現(xiàn)象，其濃度經(jīng)連續(xù)稀釋以后，心肌細胞跳動異常情況隨之消失，但當將相同濃度的人參提取物添加到成年大鼠的心肌細胞的培養(yǎng)基中時，心肌細胞未見異常[7]。這說明人參提取物對新生大鼠的心肌細胞具有一定的毒性。

細胞的形貌、結(jié)構(gòu)與細胞的生理狀態(tài)和功能有著重要的聯(lián)系，AFM對細胞表面形貌學研究與臨床研究的關(guān)系越來越密切，并具有著廣闊的應(yīng)用前景[8]。筆者通過AFM對WEG作用的VERO細胞前后形貌、超微結(jié)構(gòu)的對比，從納米尺度上直觀觀察WEG對VERO細胞形貌、結(jié)構(gòu)的變化，通過對結(jié)構(gòu)的觀察探索WEG對VERO細胞增殖抑制的機理。WEG能明顯抑制VERO細胞的體外增殖，并對VERO細胞具有一定的氧化損傷作用，通過原子力顯微鏡探測技術(shù)的引入，經(jīng)掃描成像發(fā)現(xiàn)WEG對VERO細胞的細胞膜具有一定的破壞作用。據(jù)此推斷，WEG對可能對人體的腎臟具有一定的損傷作用，隨著WEG濃度的降低，對腎臟的損傷作用有所減輕，其可能的作用機制有待進一步研究。

參考文獻

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[2] 李紅艷，趙雨，張巍，等.人參水溶性蛋白對幾種細胞增殖的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2008，30（5）：705-707.

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[5] 李慶虹，山麗梅，任永申.中藥毒性研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（5）：300-302

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