范睿等

摘 要 利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）技術(shù)分析來(lái)自不同國(guó)家的56份胡椒種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性。結(jié)果顯示：7條引物共產(chǎn)生141條清晰的譜帶，分子量在0.2～3.0 bp之間，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)100%，在一定程度上說(shuō)明胡椒資源遺傳的復(fù)雜性和多樣性。在相似性系數(shù)約為0.51的水平上將56份資源聚為3個(gè)類群，與基于ITS的研究結(jié)果類似。大胡椒與其它種質(zhì)的親緣關(guān)系均比較遠(yuǎn)，顯示出其明顯的差異性和獨(dú)特性，與其形態(tài)學(xué)分類結(jié)果一致，同時(shí)支持將頂花胡椒、光軸苧葉蒟歸入苧葉蒟，光莖胡椒作為一個(gè)變種。

關(guān)鍵詞 胡椒；種質(zhì)資源；ISSR標(biāo)記；遺傳多樣性

中圖分類號(hào) S573.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Genetic Diversity of Pepper Germplasm

Resources by ISSR Markers

FAN Rui， WU Huasong*， HAO Chaoyun， TAN Lehe， WU Gang， YANG Jianfeng

Spice and Beverage Research Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulatioin for Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China

Abstract To assess the genetic diversity of pepper germplasm resources and some taxonomic problems of Piper genus， 56 accessions were analyzed using inter-simple sequence repeat（ISSR）markers. 7 primers were screened from 100 random primers， and a total of 141 fragments were amplified ranging from 0.2～3.0 kb， all of which were polymorphic. The average number of DNA band produced by each primer was 20.1. Based on the dendrogram of UPGMA， 56 accessions could be divided into three groups at the level of 0.51， which was similar to the results of Jaramillo et al. obtained from the studies on ITS sequences. The location of P. umbellatum in the dendrogram showed that it had high level of genetic distance to other accessions， which was similar to the results of morphology and floristic geography. The high degree of correlation among P. boehmeriifolium， P. boehmeriifolium var. tonkinense， P. terminaliflorum and P. glabricaule supported well former researches， and it was reasonable to combine the first three speices into one taxon（P. boehmeriifolium）， and alter Piper glabricaule as a variety. And the phylogenetic relationships of some other species were also discussed.

Key words Pepper（Piper nigrum）； Germplasm resources； ISSR marker； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.016

胡椒（Piper nigrum）為胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）多年生木質(zhì)藤本植物，素有“香料之王”的美譽(yù)，既是世界最重要的香辛作物之一，又具有藥用價(jià)值和工業(yè)利用價(jià)值，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域可被用作健胃劑、解熱劑和支氣管粘膜刺激劑等[1-2]，在食品工業(yè)上也可用作抗氧化劑、防腐劑和保鮮劑等[3]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，2008年世界胡椒收獲面積5.53×105 hm2，總產(chǎn)量4.33×105 t，其中中國(guó)胡椒主要分布在海南、云南、廣東、廣西和福建等地，年產(chǎn)量達(dá)2.72×104 t，位居世界第五[4]。作物種質(zhì)資源包括野生近緣種、地方品種、選育品種、育種品系和遺傳材料等，蘊(yùn)藏著各種性狀的遺傳基因，是品種選育和生物學(xué)理論研究的基本材料來(lái)源[5]。胡椒野生近緣種資源極為豐富，有超過(guò)1 000個(gè)植物種類，為胡椒科重要的泛熱帶組成成分[6-7]，但許多種類外形特征極為相似，給種類準(zhǔn)確鑒定造成了困難[8-9]。胡椒地方品種、選育品種和育種品系等資源也較為豐富，地方品種如卡納瓦利、巴蘭哥塔等，各國(guó)選育品種如興熱1號(hào)、云選1號(hào)、班尼約爾、Nedumchola、Vadakkan、73-F-5等，品種遺傳背景復(fù)雜[10-11]。胡椒種質(zhì)資源物種多樣和形態(tài)相似的特點(diǎn)影響了其準(zhǔn)確分類鑒定，不利于后續(xù)的資源評(píng)價(jià)與創(chuàng)新利用工作。借助分子技術(shù)是解決分類問(wèn)題最為可靠而快捷的方法。Pradeepkumar等[12]利用RAPD（Random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記研究了22個(gè)胡椒種質(zhì)的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)除了班尼約爾-3外，其余種質(zhì)均擴(kuò)增得到了特異性譜帶；Keshavachandran等[13]也用RAPD研究了17個(gè)胡椒品種和12個(gè)蓽菝品種的指紋圖譜，所有種質(zhì)均可獲得特異性譜帶，表明該標(biāo)記可以用于胡椒種質(zhì)的鑒別。姜艷等[14]開(kāi)展海南省不同采集地胡椒種質(zhì)的ISSR遺傳多樣性分析，但主要是中國(guó)海南省內(nèi)的幾個(gè)種，種類較少。本研究利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間（Inter-simple sequence repeat，ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)來(lái)自中國(guó)、印度尼西亞、印度、巴西、伯利茲等國(guó)家或地區(qū)的56份野生近緣種、栽培品種和育種材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在揭示其親緣關(guān)系，為種質(zhì)的準(zhǔn)確鑒定提供可靠依據(jù)，并解決一些種質(zhì)分類疑問(wèn)，對(duì)今后遺傳改良、育種親本選配、種質(zhì)保護(hù)和核心種質(zhì)構(gòu)建等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

野生近緣種、主栽品種和育種材料共56份，分別引種自東南亞和中南美洲部分國(guó)家或地區(qū)，其中國(guó)內(nèi)野生近緣種30種，國(guó)外野生近緣種9種，主栽品種和育種材料等17份，活體保存于農(nóng)業(yè)部萬(wàn)寧胡椒種質(zhì)資源圃。詳見(jiàn)表1。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 取植物嫩葉樣品約100 mg，利用基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取總DNA。UV-2102型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA是否降解，濃度稀釋為50 ng/μL，備用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 經(jīng)不同反應(yīng)條件擴(kuò)增對(duì)比分析，建立最佳ISSR反應(yīng)體系及程序[15]。25 uL反應(yīng)體系：含1×PCR buffer，2 mmol/L Mg2+，200 μmol/L dNTPs，2 μmol/L引物，100 ng模板，1 U Taq DNA聚合酶。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 120 s，復(fù)性（據(jù)不同引物的退火溫度）60 s，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物均用含有DuGreen的1.5%瓊脂糖凝膠在1×TBE中電泳，上樣量 5 μL，電壓4 V/cm。電泳結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上檢測(cè)拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將擴(kuò)增片段作為顯性標(biāo)記，按照有（1）和無(wú)（0）記錄電泳譜帶，構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。應(yīng)用PopGen32軟件包計(jì)算Shannon多樣性指數(shù)、Nei's無(wú)偏遺傳距離?；贜ei's多樣性指數(shù)矩陣，采用無(wú)權(quán)重配對(duì)算術(shù)平均數(shù)法（Unweighted pair group method with arithmatic mean，UPGMA）構(gòu)建系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)，基于ISSR表型數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性

從100條ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物7條，對(duì)所有樣品進(jìn)行多樣性分析。結(jié)果顯示，7條引物共檢測(cè)到141個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)引物檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)在10～26個(gè)之間，平均為20.1個(gè)，DNA片段大小分布在0.2～3.0 kb之間（圖1），反應(yīng)中所用引物序列大多富含（GT）n或（TG）n、（AG）n或（GA）n和（AC）n等二核苷酸重復(fù)序列（表2），所有條帶均具有多態(tài)性，多態(tài)位點(diǎn)比例達(dá)100%。Shannon多樣性指數(shù)評(píng)價(jià)樣品遺傳多樣性結(jié)果表明：平均多樣性指數(shù)（I）為0.560 1，每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）為0.379 9（表2）。可見(jiàn)，上述胡椒種質(zhì)資源的多態(tài)性條帶極為豐富，在一定程度上說(shuō)明其遺傳背景的復(fù)雜性和遺傳多樣性的豐富性。

2.2 遺傳相似性系數(shù)分析

根據(jù)條帶矩陣計(jì)算Nei's遺傳相似性指數(shù)，按照UPGMA法生成表征種質(zhì)間親緣關(guān)系的樹(shù)狀聚類圖（圖2）。由7條引物擴(kuò)增帶計(jì)算得到的56份胡椒種質(zhì)資源的Nei's遺傳相似性指數(shù)在0.305～0.933之間變動(dòng)，平均值為0.574，其中大胡椒（DHJ）與班293（B293）之間的相似性系數(shù)最小（0.305），雜交種質(zhì)柬印43（JY43）與柬印93（JY93）之間最高（0.933）。聚類結(jié)果表明，在相似性系數(shù)約為0.51水平上可將56份樣品聚為3個(gè)類群：（1）原產(chǎn)亞洲的胡椒野生近緣種資源，以及栽培品種和育種材料；（2）原產(chǎn)美洲的野生近緣種；（3）廣泛分布于東南亞、美洲和非洲的大胡椒。可見(jiàn)，在大的地理范圍內(nèi)，胡椒資源遺傳親緣關(guān)系與地理距離存在一定的相關(guān)性。

主成分分析可排除重疊和分類意義不大的條帶，使重要因素突顯出來(lái)。特征根大小代表各綜合指標(biāo)對(duì)總遺傳方差貢獻(xiàn)的大小，特征向量表示各性狀對(duì)綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)的大小。由表3和圖3可見(jiàn)，第1主成分所占信息量?jī)H21.91%，前3個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率僅有37.58%，直到第8個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率才達(dá)到54.45%，各性狀貢獻(xiàn)率分散，累積貢獻(xiàn)率增長(zhǎng)不明顯，說(shuō)明胡椒資源在形成演化過(guò)程中基因變異的多方向性和復(fù)雜性。

3 討論與結(jié)論

遺傳多樣性是生物所攜帶遺傳信息的總和，代表該物種在特定環(huán)境中基因的豐富程度，是植物選育及研究中最重要與最有價(jià)值的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究顯示，胡椒種質(zhì)資源平均Nei's相似性指數(shù)僅為0.574，遺傳多樣性水平極高，遺傳變異明顯，與以往的研究結(jié)果基本一致。如Pradeepkumar等[16]和施江等[17]分別利用RAPD和AFLP標(biāo)記技術(shù)對(duì)胡椒栽培種與野生近緣種的遺傳關(guān)系進(jìn)行了研究，其中多態(tài)位點(diǎn)百分率均高達(dá)98%以上，遺傳多樣性水平極高。對(duì)胡椒種質(zhì)資源遺傳多樣性極高的現(xiàn)象，分析認(rèn)為，胡椒屬植物多為木質(zhì)藤本植物，壽命長(zhǎng)、雌雄異株、風(fēng)媒傳粉，后代極易產(chǎn)生基因變異，因此其高水平的遺傳多樣性也不難理解。同時(shí)，主成分分析的累計(jì)貢獻(xiàn)率增長(zhǎng)不明顯，貢獻(xiàn)率分散，說(shuō)明本類群在演化過(guò)程中遺傳變異的無(wú)規(guī)律性，與基于形態(tài)表型特征的研究結(jié)果基本一致[9]。

作物種質(zhì)資源包括野生近緣種、地方品種、選育品種、育種品系和遺傳材料等，是優(yōu)異品種篩選和培育的重要性狀材料來(lái)源，被認(rèn)為是最有價(jià)值和戰(zhàn)略意義的物質(zhì)財(cái)富而受到越來(lái)越多的重視。目前，關(guān)于胡椒野生近緣種遺傳多樣性與分子系統(tǒng)學(xué)已開(kāi)展了部分研究。由本研究可見(jiàn)，56份胡椒種質(zhì)可聚為3大分支，亞洲熱帶進(jìn)化支、美洲熱帶進(jìn)化支以及泛熱帶分布的大胡椒進(jìn)化支，與以往研究基本一致?；诤颂求wDNA（nrDNA）ITS（Internal transcribed spacers，ITS）序列，發(fā)現(xiàn)世界范圍內(nèi)胡椒屬植物可形成了三大分支：亞洲熱帶進(jìn)化支、美洲熱帶進(jìn)化支和南太平洋島嶼進(jìn)化支，表明胡椒屬植物親緣關(guān)系與其地理距離存在相關(guān)性[18]。Parthasarathy等[19]應(yīng)用GIS和聚類分析多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的種類常出現(xiàn)在相同或鄰近地區(qū)，表明在小的區(qū)域范圍內(nèi)，該植物類群親緣關(guān)系與地理距離呈較強(qiáng)的正相關(guān)。但在亞洲熱帶進(jìn)化支內(nèi)，地理距離較遠(yuǎn)的種類反而具有較近的親緣關(guān)系，物種相似性并未表現(xiàn)出地域性特征，與以往研究結(jié)果存在一定差異，具體原因還有待開(kāi)展分子系統(tǒng)學(xué)等方面的工作。

大胡椒穗狀花序多數(shù)、通常2-7復(fù)作傘形花序式排列，與胡椒屬其他物種差異明顯，被Willdenow等植物學(xué)家列入大胡椒屬（Pothomorphe）[20]，而主張大種概念的林奈則將其歸入胡椒屬。從本文結(jié)果看，大胡椒與其他胡椒種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，單獨(dú)聚為一個(gè)分支，表現(xiàn)出明顯的差異性和獨(dú)特性。1982版《中國(guó)植物志》將苧葉蒟（P. boehmeriaefolium）、頂花胡椒（P. terminaliflorum）、光莖胡椒（P. glabricaule）作為3個(gè)物種區(qū)別對(duì)待，而光軸苧葉蒟（P. boehmeriaefolium var. tonkinense）作為1個(gè)變種，后來(lái)Gilbert和夏念和[21]等建議將頂花胡椒、光軸苧葉蒟歸入苧葉蒟，而光莖胡椒作為變種（P. boehmeriifolium var. glabricaule）?；诒疚腎SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果可見(jiàn)，上述4個(gè)種質(zhì)作為1個(gè)小分支聚在一起，其中光軸苧葉蒟與苧葉蒟的Nei's相似性水平達(dá)0.843，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，支持最新分類結(jié)果。球穗胡椒為中國(guó)西南部常見(jiàn)種，以葉具暗紅色腺體、葉背灰白色、果序短為特征，而腺脈蒟Piper bavinum通常有更長(zhǎng)果序和缺少粉白色被毛而與球穗胡椒區(qū)別，但后來(lái)發(fā)現(xiàn)這些差別呈連續(xù)性，因此將它們作為一個(gè)類群[21]。由本研究結(jié)果可知，采自云南的球穗胡椒與采自海南的腺脈蒟在相似性0.741水平上聚在一起，相對(duì)于其他物種表現(xiàn)出更近的親緣關(guān)系，但是否能否歸入一個(gè)類群有待深入研究。

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責(zé)任編輯：趙軍明