王成韜 鐘秋平 李永成

摘 要 以海南粗榧（Cephalotaxus mannii Hk. f.）的枝條、葉為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，采用升汞、次氯酸鈉與臭氧為消毒劑，探討不同滅菌方法對(duì)海南粗榧外植體污染和細(xì)胞活性的影響。結(jié)果表明，以升汞與臭氧復(fù)合處理的滅菌方法最佳，最佳滅菌條件為：75%酒精滅菌1 min，臭氧滅菌30 min，再用0.1% HgCl2溶液滅菌10 min。在此條件下，外植體污染率5%，愈傷組織誘導(dǎo)率95%，外植體細(xì)胞活力比對(duì)照提高38%。

關(guān)鍵詞 海南粗榧；臭氧滅菌；細(xì)胞活力；污染率

中圖分類號(hào) Q942.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Explants Sterilization Conditions of Cephalotaxus mannii Hk. f.

WANG Chengtao，ZHONG Qiuping，LI Yongcheng*

Food College， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract The branches and leaves of Cephalotaxus mannii Hk. f. were used as the explants for callus induction. In addition， mercuric chloride， sodium hypochlorite and ozone were used as the disinfectants. The impact of different sterilization methods on contamination rate and cell activity of explants was studied in the paper. The results were as follows： The combinative sterilization of mercuric chloride and ozone showed the best effect. Sterilization conditions were as follows： 75% alcohol for 1 min， ozone for 30 min and 0.1% HgCl2 solution for 10 min. It resulted in 5% of contamination rate of explants and 95% of callus induction rate， enhanced 38% of cell activity than the control under the sterilization conditions indicated as above.

Key words Cephalotaxus mannii Hk. f.；Ozone sterilization；Cell activity；Contamination rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.018

海南粗榧（C. mannii Hk. f.）是三尖杉科植物中分布最南的一種，是海南的特有植物。其中的抗癌活性成分三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿、脫氧三尖杉酯堿和異三尖杉酯堿4種具有抗癌作用的粗榧?jí)A在所有的三尖杉科三尖杉屬植物中含量最高，因此受到人們的廣泛關(guān)注[1]。海南粗榧人工繁殖很困難，且生長(zhǎng)速度緩慢[2]。因此，采用組織培養(yǎng)合成這些抗癌生物堿是解決其藥源植物可持續(xù)發(fā)展的有效技術(shù)手段。張偉等[3]對(duì)三尖杉（C. fortunei）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物堿進(jìn)行了研究。在海南粗榧（C. mannii）的組織培養(yǎng)中， 符文英等[4]利用溫室苗作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織獲得成功，劉進(jìn)平[5]在利用野生海南粗榧誘導(dǎo)愈傷組織的過(guò)程中均出現(xiàn)嚴(yán)重污染，并指出野生海南粗榧污染嚴(yán)重，較難獲得愈傷組織。

外植體消毒滅菌，要求滅菌徹底，同時(shí)要求盡量減低對(duì)外植體細(xì)胞的傷害[6]。由于常年高溫多雨，空氣濕度大，熱帶、南亞熱帶生長(zhǎng)的植物莖葉表面容易附生或共生各種微生物，它們可侵入植物表皮內(nèi)的薄壁組織，很難被清除而隨植物材料進(jìn)入培養(yǎng)基中，引起組培中內(nèi)生菌污染[7-8]。朱廣廉[9]在熱帶植物相思樹(shù)外植體滅菌中采用殺菌劑苯菌靈、鏈霉素與升汞復(fù)合處理，取得了良好效果。在一定濃度下， 臭氧可迅速殺滅細(xì)菌、芽胞、病毒、真菌及其孢子等[10]，臭氧在水中的殺菌速度比氯快[11]，由于其安全方便、環(huán)保、消毒效果好、時(shí)間短等特點(diǎn)， 被制藥工業(yè)企業(yè)廣泛應(yīng)用。為解決海南粗榧組織培養(yǎng)中外植體內(nèi)生菌的污染問(wèn)題，本研究采用臭氧來(lái)殺滅植物內(nèi)生菌，以期獲得較好的滅菌效果，為建立海南粗榧離體培養(yǎng)技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

海南粗榧（C.mannii）外植體采自海南省儋州市熱帶植物園、霸王嶺國(guó)家自然保護(hù)區(qū)和尖峰嶺國(guó)家自然保護(hù)區(qū)。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+NAA 1 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+2，4-D 2 mg/L+蔗糖30 g/L +卡拉膠6 g/L[4]。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌 外植體預(yù)處理，洗潔精液清洗15 min，流水沖洗30 min，然后用75%酒精滅菌1 min。

常規(guī)升汞滅菌法：選取海南粗榧嫩葉，經(jīng)預(yù)處理后用0.1%HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，并統(tǒng)計(jì)污染率與誘導(dǎo)率。

升汞和次氯酸鈉復(fù)合滅菌法[12]： 選取海南粗榧嫩葉做外植體，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，用5%次氯酸鈉溶液（有效氯）滅菌15 min，再用0.1% HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計(jì)污染率與誘導(dǎo)率。

升汞和臭氧復(fù)合滅菌法：選取海南粗榧嫩葉做外植體，經(jīng)過(guò)預(yù)處理后放入三角瓶并用無(wú)菌水浸泡，通入臭氧滅菌30 min，再用0.1% HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計(jì)污染率與誘導(dǎo)率。

殺菌劑和抗生素復(fù)合滅菌法[13-15]：選取海南粗榧嫩葉，將其放入1 ∶ 200新潔爾滅稀釋液中磁力攪拌15 min[16]，75%酒精滅菌1 min，轉(zhuǎn)入到0.2%苯菌靈+0.2%鏈霉素+0.02%檸檬酸溶液中，于25 ℃，100 r/min搖床上震蕩16 h，然后用0.1% HgCl2溶液分別滅菌10、14、17、20 min。

1.2.2 植物細(xì)胞活力檢測(cè)方法 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法[17]：剪碎100 mg海南粗榧嫩葉于試管中，加入3 mL TCC溶液（0.5 g TTC溶于100 mL，0.05 mol/L， pH 7.5的磷酸緩沖液中），在25 ℃下反應(yīng)12 h。離心棄TTC溶液并收集植物材料，用蒸餾水清洗3次，加入3 mL 95%酒精后60 ℃恒溫水浴10 min，抽提植物材料中酶反應(yīng)生成的紅色物質(zhì)，離心棄植物材料，冷卻，在492 nm處測(cè)吸光值。細(xì)胞活力單位以每克外植體（Fresh weight， FW）在492 nm處的吸光值表示（OD/g）。

植物細(xì)胞活力以相對(duì)活力表示，以未做滅菌處理的嫩葉為對(duì)照，其相對(duì)活力定義為1，外植體細(xì)胞相對(duì)活力=滅菌后外植體細(xì)胞活力/對(duì)照嫩葉細(xì)胞活力。

1.2.3 外植體的培養(yǎng) 外植體通過(guò)以上方法滅菌后，用200 mL去離子無(wú)菌水搖床清洗5次，每次10 min，然后用無(wú)菌濾紙吸干其表面水分，切為1.5 cm左右，然后接種到培養(yǎng)基中，每瓶2個(gè)外植體，27 ℃暗培養(yǎng)。每個(gè)處理接10瓶，每個(gè)處理重復(fù)3次，計(jì)算污染率、誘導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)升汞滅菌對(duì)海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可知，污染率隨升汞滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)降低的；愈傷組織誘導(dǎo)率隨著升汞滅菌時(shí)間的增加而降低。說(shuō)明滅菌時(shí)間對(duì)污染與愈傷組織誘導(dǎo)均有明顯影響；HgCl2對(duì)雜菌與植物細(xì)胞均有殺滅作用，過(guò)長(zhǎng)的滅菌時(shí)間，同時(shí)也殺滅植物細(xì)胞。因而，17 min是一個(gè)較優(yōu)的滅菌時(shí)間。

2.2 升汞和次氯酸鈉復(fù)合滅菌法對(duì)海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表2可知，次氯酸鈉滅菌15 min后，HgCl2滅菌時(shí)間在14 min以上時(shí)，污染率為0；愈傷組織在HgCl2滅菌10 min的誘導(dǎo)率為60%，但在后續(xù)培養(yǎng)，出現(xiàn)部分外植體褐變死亡的現(xiàn)象，隨著滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體全部褐變死亡，說(shuō)明次氯酸鈉對(duì)植物組織有較大的損害作用。

2.3 升汞和臭氧復(fù)合滅菌對(duì)海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表3可知，臭氧滅菌30 min后，升汞滅菌10 min時(shí)，污染率只有5%，在14 min以上時(shí)，污染率均為0；升汞滅菌10 min誘導(dǎo)率為95%，與其它滅菌時(shí)間有明顯差異。升汞滅菌10 min，10 d后外植體即出現(xiàn)局部膨大現(xiàn)象。滅菌時(shí)間>14 min時(shí)，外植體并沒(méi)有全部死亡，均能成功誘導(dǎo)出愈傷組織，說(shuō)明臭氧既能起到良好的殺菌作用，能減少升汞的滅菌時(shí)間從而降低其對(duì)外植體的損害。升汞滅菌10 min，雖然有少量的污染（污染率5%），但其愈傷組織誘導(dǎo)率最高（95%），愈傷組織后續(xù)生長(zhǎng)良好。所以0.1% HgCl2和臭氧復(fù)合滅菌為最佳滅菌組合，最優(yōu)滅菌條件為臭氧滅菌30 min，0.1%HgCl2溶液滅菌10 min，獲得的愈傷組織呈淡黃色，質(zhì)地松散（圖1）。

2.4 殺菌劑和抗生素復(fù)合滅菌法對(duì)海南粗榧外植體污染與愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表4可知，殺菌劑和抗生素復(fù)合滅菌法對(duì)植物組織有較大傷害，外植體移接到培養(yǎng)基2～3 d后出現(xiàn)褐變死亡，最終全部死亡。說(shuō)明殺菌劑和抗生素復(fù)合滅菌方法雖能殺死內(nèi)生菌，同時(shí)也傷害植物組織。

2.5 不同滅菌方法對(duì)嫩葉外植體細(xì)胞活性的影響

由圖2可知，三種滅菌方法對(duì)嫩葉外植體細(xì)胞活性存在明顯差異，臭氧與升汞復(fù)合滅菌法影響最小，升汞滅菌法次之，次氯酸鈉與升汞復(fù)合滅菌法影響最大；升汞單獨(dú)滅菌前17 min，細(xì)胞活力下降不明顯，細(xì)胞活力只下降8%，但滅菌20 min，活力下降29%，具顯著差異；升汞和次氯酸鈉聯(lián)合滅菌14 min后對(duì)植物細(xì)胞活力即有顯著差異，滅菌20 min后，其細(xì)胞活力下降60%；升汞與臭氧聯(lián)合滅菌有提高細(xì)胞活力的作用，盡管隨滅菌時(shí)間延長(zhǎng)，活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但不同滅菌時(shí)間對(duì)植物細(xì)胞活力無(wú)明顯差異。

3 討論與結(jié)論

TTC法驗(yàn)證了不同滅菌方法對(duì)植物細(xì)胞活性的影響。升汞滅菌時(shí)間的延長(zhǎng)使細(xì)胞活性逐漸降低，但17 min前無(wú)明顯差異，20 min才達(dá)到明顯差異，升汞使細(xì)胞活性下降的主要原因是使植物細(xì)胞蛋白質(zhì)變性，但植物組織對(duì)升汞的滲透性差，阻礙其作用，因此需有相應(yīng)作用時(shí)間才能使細(xì)胞活性出現(xiàn)明顯下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，次氯酸鈉溶液對(duì)植物外植體造成較嚴(yán)重的傷害，短時(shí)間作用（14 min）就可使細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯下降，造成愈傷組織誘導(dǎo)率低，效果最差。這可能與次氯酸鈉強(qiáng)烈的氧化作用及較好的組織滲透性有關(guān)，另外次氯酸鈉對(duì)植物材料特別是葉子有強(qiáng)的漂白作用。外植體經(jīng)過(guò)臭氧滅菌后細(xì)胞活力反而高于空白對(duì)照，可能與臭氧的護(hù)色作用作用有關(guān)。本試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，用次氯酸鈉滅菌時(shí)，植物脫色很厲害，植物馬上死亡，而臭氧處理的植物，顏色很鮮綠，活力高；其次TTC測(cè)定活力的原理是作為脫氫酶的受氫體被還原成為紅色物質(zhì)，因此植物細(xì)胞活性測(cè)定結(jié)果與其細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶活性密切相關(guān)。植物中殘留的臭氧分子可能消耗脫氫酶產(chǎn)生的氫，從而使脫氫反應(yīng)不斷進(jìn)行，對(duì)脫氫酶有激活作用，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

消毒是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，組織培養(yǎng)中外植體消毒好壞直接影響到后續(xù)的研究。本試驗(yàn)引入臭氧對(duì)熱帶植物外植體進(jìn)行滅菌，臭氧具有殺菌迅速，可以彌散而均勻，殺菌無(wú)死角等特點(diǎn)。在75%酒精1 min，臭氧滅菌30 min，0.1% HgCl2溶液10 min時(shí)，可獲得較低的污染率（5%）與較高的愈傷組織誘導(dǎo)率（95%），解決了野生海南粗榧外植體污染嚴(yán)重的問(wèn)題。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所編著. 中草藥現(xiàn)代研究（第二卷）[M]. 北京： 北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1996： 143-128.

[2] 中國(guó)科學(xué)院植物研究所. 中國(guó)植物紅皮書-瀕危植物（第一冊(cè)）[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1992： 24.

[3] Zhang Wei， Bai Xuefang， Bu Zongshi， et al. Enhanced production of harringtonine and homoharringtonine in Cephalotaxus fortunei calli culture by periodic temperature oscillation[J]. Biotechnology Letters， 1998， 20（1）： 63-66.

[4] 符文英， 杜道林， 符木均. 海南粗榧愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2004， 2（40）： 34-36.

[5] 劉進(jìn)平， 吳佳靜， 黃艷麗，等. 海南粗榧外植體滅菌與愈傷組織誘導(dǎo)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2010， 33（1）： 39-41.

[6] 趙春莉， 李金英. 植物組織培養(yǎng)中污染原因及其控制方法[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010， 35（6）： 11-13.

[7] 周俊輝， 周厚高. 植物組織中內(nèi)生細(xì)菌污染問(wèn)題[J]. 廣西植物， 2003， 23（1）： 64-70.

[8] Leifert C， Wites WM. Contaminants of plant tissue cultures[J]. Int Assoe Plant Tissue Culture Newsl， 1990， 12（4）： 64-70.

[9] 朱廣廉. 植物組織培養(yǎng)中的外植體滅菌[J]. 植物生理學(xué)通訊，1996， 32（6）： 444-449.

[10] 虞水紅， 李愛(ài)國(guó)， 劉 培. 超臭氧消毒與臭氧消毒機(jī)的研制[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備， 2005， 1（2）： 38-39.

[11] 金雪梅， 付亞冰， 吳 波. 臭氧滅菌在藥品生產(chǎn)中的應(yīng)用初探[J]. 中華醫(yī)藥雜志， 2003， 8（3）； 43-45.

[12] 周 鵬， 鄭學(xué)勤， 陳向明. 成齡番木瓜的快繁技術(shù)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 1995， 16（2）： 66-69.

[13] Bistrichanov S， Haralampieva V， Kaloyanova N. Testing of different types of antibiotics against bacterial contamination in Hydrangea hortensis in vitro[J]. Bulgarian Journal of Agricultural Science， 1997， 3（6）： 749-753.

[14] Barrett C， Cassells AC. An evaluationof antibiotics for the elimination of Xanthomonas campestris pv.pelargonii（Brown） from Pelargonium domesticumcv. ‘Grand Slamexplants in vitro[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture， 1994， 36（2）： 169-175.

[15] 翟建中， 顧梅俏. 長(zhǎng)春蔓組培生產(chǎn)中污染的防除[J]. 森林病蟲(chóng)通訊， 1999（4）： 30-32.

[16] 肖顯華， 王順珍，林榮雙. 植物材料表面消毒方法的改進(jìn)[J]. 生物技術(shù)， 1999， 9（1）： 43-45.

[17] 王秀琴， 鄭 群. 不同藥劑處理對(duì)柴胡種子活力的影響[J]. 種子， 2002（2）： 23-24.

責(zé)任編輯：古小玲