李云

深圳市龍崗區(qū)南灣人民醫(yī)院外科，廣東 深圳 518000

腸道干細(xì)胞移植對創(chuàng)傷后腸黏膜屏障功能障礙的影響

李云

深圳市龍崗區(qū)南灣人民醫(yī)院外科，廣東 深圳 518000

目的：觀察腸道干細(xì)胞移植對創(chuàng)傷后腸黏膜屏障的治療作用，尋找腸道干細(xì)胞治療腸黏膜屏障功能障礙的方法。方法：利用熒光激活細(xì)胞分類法將腸上皮干細(xì)胞分離，通過腸腔人工生物支架等組織工程方法建立理想的ISC移植模型，實(shí)現(xiàn)腸道干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并將體外分離培養(yǎng)的腸道干細(xì)胞群移植入放射性小腸損傷動物模型鼠腸腔中。結(jié)果：正常組大鼠小腸黏膜各層結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊；模型組7天大鼠黏膜絨毛嚴(yán)重受損，脫落明顯；治療組7天黏膜破壞較少，黏膜增厚，逐漸恢復(fù)正常。同時對治療組和模型組進(jìn)行RIS評分比較，結(jié)果顯示治療組的黏膜損傷程度明顯低于模型組（P＜0.05）。結(jié)論：ISCs移植可促進(jìn)損傷后腸黏膜的修復(fù)，腸道干細(xì)胞移植有望成為治療某些腸道疾病的新方法。

腸黏膜屏障功能障礙；腸道干細(xì)胞；移植

正常腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障、生物屏障構(gòu)成，能有效阻止腸道內(nèi)細(xì)菌和內(nèi)毒素易位。機(jī)體在遭受各種創(chuàng)傷如放射性損傷后，腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)將發(fā)生一系列病理生理變化，如腸黏膜萎縮、腸絨毛短而稀疏，可導(dǎo)致黏膜通透性增加，黏膜屏障功能障礙，使腸腔內(nèi)細(xì)菌穿過腸黏膜屏障到達(dá)其他器官定植和過度生長，引發(fā)感染，甚至出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和多器官功能障礙綜合征（MODS），嚴(yán)重者可危及生命。因此，探索創(chuàng)傷（放射性損傷）后腸黏膜屏障功能障礙的有效治療方法，減少其對機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p害具有重要的臨床價值。本研究擬利用熒光激活細(xì)胞分類法將腸上皮干細(xì)胞分離，然后通過腸腔人工生物支架等組織工程方法建立理想的ISC移植模型，實(shí)現(xiàn)腸干細(xì)胞體外培養(yǎng)，將體外分離培養(yǎng)的腸干細(xì)胞群移植入放射性小腸損傷動物模型鼠腸腔中，觀察ISCs對放射性小腸損傷的修復(fù)作用，探討治療腸黏膜屏障功能障礙的新途徑。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑及儀器Hoechst33342、碘化丙啶溶液（均購自Sigma Corporation）；兔抗musashi1多克隆抗體（Chemicon）；HBSS溶液（Gibco）；中性蛋白酶、Ⅲ型膠原（FACS420）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司），兔抗musashi-1多克隆抗體（Chemicon）。

1.2腸上皮干細(xì)胞的分離、鑒定及培養(yǎng)參照Dekaney CM等［1］方法：將小鼠空腸段剪碎至1 m m3大小，利用中型蛋白酶和Ⅲ型膠原將組織塊消化，經(jīng)70μm孔濾膜過濾后制成每100μL含1×106個細(xì)胞懸液；熒光染色劑Hoechst33342（濃度5mL），37℃孵育90分鐘；再與FIT C標(biāo)記的抗CD45抗體（滴度為1∶100）低溫孵育10分鐘，以區(qū)別造血干細(xì)胞，然后加濃度為2μg/m L碘化吡啶（PI）溶液4℃染色10～1 5分鐘，以區(qū)別死亡細(xì)胞；接著在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行S P細(xì)胞分離，利用波長350nm紫外光源激發(fā)Hoechst33342和PI，450nm/30nm帶通收集藍(lán)光，670nm/30nm帶通及655nm長通收集紅光；575nm/26nm帶通收集PI發(fā)射的紅光。去除PI陽性死亡細(xì)胞后，收集、分離Hoechst33342陽性和陰性細(xì)胞。將腸道組織作為腸上皮干細(xì)胞的生長支架，參照StelznerM等［2］利用EDTA將小鼠小腸黏膜剝離，保留黏膜下組織，然后把分離的腸干細(xì)胞移植至經(jīng)上述方法處理后的腸腔中。

1.3干細(xì)胞特性鑒定檢測Musashi-lmRNA表達(dá)水平。培養(yǎng)細(xì)胞按RNeasy Mega總RNA提取試劑盒操作說明提取總R N A，以o l i g o d T j為引物，用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄cDNA，最后以逆轉(zhuǎn)錄的c D N A為模板；以上游引物5′C G A G C T C G A C T C C A A A A C A A T-3′，下游引物5′-G G C T T T C T T G C A T T C C A C C A-3′進(jìn)行R T-P C R擴(kuò)增；條件為：9 4 C 2 m i n變性，9 4 C l 5 S，5 3 C 3 0 S，7 2 C 3 0 S，擴(kuò)增3 5個循環(huán)，P C R產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳鑒定。

1.4放射性腸損傷動物模型的建立選用成年Wistar雌性大鼠30只，體質(zhì)量240～260g。10%水合氯醛麻醉（3.5m L/kg），仰臥在特制的固定盒中，以X.S.S.Z250型深部X線機(jī)（貴陽醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)）給予全腹部照射，大鼠腹部給予1 c m的組織補(bǔ)償，從劍突到恥骨聯(lián)合，照射面積為8.5cm×8.5cm，源皮距60cm，單次照射劑量5Gy，每隔7 2小時照射1次，共5次。

1.5動物分組將輻射大鼠隨機(jī)分為ISCs治療組、模型組、正常對照組各10只。ISCs治療組大鼠分別于第3、4、5次照射后，當(dāng)日尾靜脈注射同種異體腸干細(xì)胞1mL，濃度為每100μL含1×106個細(xì)胞；正常對照組和模型組不做其他處理，于最后一次注射ISCs后第7天處死各組動物，免疫組化染色觀察小腸黏膜結(jié)構(gòu)。

1.6放射性腸損傷評分（RIS）對移植后第7天模型組大鼠進(jìn)行R I S評分，分析放射性腸損傷黏膜組織形態(tài)變化，具體評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［3］。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠腸道干細(xì)胞的分離培養(yǎng)結(jié)果分離出CD44和Hoechst33342雙陰性SP細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的1.1%～2.1%，雖然高于腸上皮干細(xì)胞比例的理論數(shù)值（0.5%），卻表明小鼠小腸段含有較豐富的腸上皮干細(xì)胞；新生小鼠來源的小腸黏膜單細(xì)胞懸液中包含的特定細(xì)胞群體即側(cè)群細(xì)胞，染包液中加入維拉帕米后，側(cè)群細(xì)胞被阻斷后消失，經(jīng)RT-PC R擴(kuò)增，側(cè)群細(xì)胞中顯示有MSI-1 mRNA及蛋白的表達(dá)；新生小鼠的小腸黏膜側(cè)群細(xì)胞富集小腸黏膜干細(xì)胞。

2.2各組大鼠小腸黏膜組織學(xué)觀察結(jié)果正常組大鼠小腸黏膜各層結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊；模型組7天大鼠黏膜絨毛嚴(yán)重受損，脫落明顯，排列紊亂，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)明顯水腫，炎性細(xì)胞浸潤；治療組7天黏膜破壞較少，黏膜增厚，絨毛逐步再生，逐漸恢復(fù)正常（見圖1—2）。RIS評分顯示治療組大鼠黏膜損傷程度明顯低于模型組（P＜0.05），見表1。

圖1　損傷后的腸黏膜病理形態(tài)

表1　照射損傷后大鼠RIS評分

圖2　ISCs移植后逐漸修復(fù)的腸黏膜形態(tài)

3　討論

腸黏膜是更新很快的組織，目前認(rèn)為腸道干細(xì)胞增生、分化是腸黏膜更新的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。腸道干細(xì)胞參與腸道正常生理過程和一些病理過程，位于腸黏膜隱窩基底部，即基底隱窩是腸道干細(xì)胞的細(xì)胞庫。腸上皮所有細(xì)胞均來自隱窩干細(xì)胞。腸上皮經(jīng)歷了艱難而又卓越的進(jìn)化，增殖的隱窩和分化的絨毛折疊形成的“谷”和“脊”構(gòu)成了獨(dú)一無二的二維拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，這對于維持腸道屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性以及損傷后的修復(fù)具有重要作用［4］。

近年研究表明腸道上皮存在一類組織特異性腸道干細(xì)胞（ISCs），ISCs具有長期自我更新潛能和產(chǎn)生至少一種終末分化細(xì)胞的能力［5］，其中尤為突出的研究結(jié)果是揭示了腸上皮干細(xì)胞的持續(xù)增殖、分化，以及對促進(jìn)腸道損傷后結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)的研究。已有研究證實(shí)體外存活生長的腸道干細(xì)胞可以被外來基因所轉(zhuǎn)染，KawaguchiAL等［6］通過研究證實(shí)基因轉(zhuǎn)染的IEC6細(xì)胞（來源于腸道隱窩的細(xì)胞）移植至網(wǎng)膜下或小腸內(nèi)可以存活，并且迅速生長，采用聚碳酸酯膜作為載體，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)［7］移植的腸道干細(xì)胞可持續(xù)生長并穩(wěn)定表達(dá)基因產(chǎn)物，骨髓或干細(xì)胞移植對炎癥性腸病有治療作用。

隨著細(xì)胞分選和基因標(biāo)記技術(shù)的逐漸成熟，干細(xì)胞研究由原來的干細(xì)胞移植雛形-骨髓移植研究逐步發(fā)展成為一門新興學(xué)科。作為機(jī)體內(nèi)細(xì)胞更新最快的組織器官之一小腸，其干細(xì)胞的研究日益受到人們的關(guān)注。腸上皮干細(xì)胞具有終身自我更新的能力［8］，由于小腸黏膜單層上皮細(xì)胞的簡單結(jié)構(gòu)和特有的晝夜更新節(jié)律，使得小腸干細(xì)胞成為繼造血干細(xì)胞和皮膚干細(xì)胞之后新的研究熱點(diǎn)。同時，由于部分腸道疾病導(dǎo)致的黏膜破壞，腸功能難以自我代償，小腸干細(xì)胞移植為腸黏膜的再生和腸黏膜屏障功能的恢復(fù)提供了新的前景。前期研究通過“微克隆分析法”發(fā)現(xiàn)，腸道隱窩的某些細(xì)胞具有重建上皮的能力。腸道上皮損傷后，這些位于李培昆氏（1ieberkuhn）隱窩的干細(xì)胞具有很強(qiáng)的組織修復(fù)作用，以維持上皮的完整性。PottenCS等［9］報道，小腸放射性損傷模型的小腸隱窩干細(xì)胞在胰島索樣生長因子和肝細(xì)胞生長因子的作用下能夠迅速分化修復(fù)損傷。將小鼠含有干細(xì)胞的隱窩“細(xì)胞團(tuán)（organoid）”分離出來并接種到受體小鼠的皮下等部位后發(fā)現(xiàn)，這些細(xì)胞團(tuán)能夠形成新的黏膜樣結(jié)構(gòu)，并且具有一定的原始腸黏膜功能。通過組織工程技術(shù)將隱窩細(xì)胞團(tuán)種植到小鼠腹腔內(nèi)培育了新的原始小腸，并將這些原始小腸與正常小鼠空腸吻合。結(jié)果顯示，這些新產(chǎn)生的小腸形態(tài)、增殖速度、解剖學(xué)特征以及轉(zhuǎn)運(yùn)功能等都與正常黏膜類似。這些實(shí)驗(yàn)的成功使腸道干細(xì)胞移植從基礎(chǔ)到臨床又邁進(jìn)了一步。本研究利用熒光激活細(xì)胞分類法成功完成了腸上皮干細(xì)胞分離，然后通過腸腔的人工生物支架等組織工程方法建立了理想的ISC移植模型，為腸上皮干細(xì)胞提供良好的生長環(huán)境，實(shí)現(xiàn)腸干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，并成功建立了放射性小腸損傷模型，將體外分離培養(yǎng)的腸干細(xì)胞群移植入放射性小腸損傷動物模型鼠腸腔中，通過免疫組化染色觀察ISCs對放射性小腸損傷的修復(fù)作用，結(jié)果顯示正常組大鼠小腸黏膜各層結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊；模型組7天大鼠黏膜絨毛嚴(yán)重受損，脫落明顯，排列紊亂，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，間質(zhì)明顯水腫，炎性細(xì)胞浸潤；治療組7天黏膜破壞較少，黏膜增厚，逐漸恢復(fù)正常，說明ISCs參與了放射性小腸損傷的修復(fù)過程。

當(dāng)前對于胃腸道黏膜屏障的治療主要集中于胃腸道黏膜屏障的保護(hù)方面，包括氧化劑、谷氨酰胺、短鏈脂肪酸以及微生態(tài)制劑等的應(yīng)用，但隨著損傷的進(jìn)一步加重，單純保守治療常難以治愈。隨著研究方法的不斷進(jìn)步，腸上皮干細(xì)胞的許多生物學(xué)特征將被揭示，可為提高消化道黏膜疾?。ㄈ缥詹涣肌兒湍[瘤等）的治療水平奠定理論基礎(chǔ)，也可為腸上皮干細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。隨著腸干細(xì)胞移植治療及腸道黏膜屏障研究的不斷深入，胃腸黏膜損傷，尤其是炎癥性腸病等一系列自身免疫性疾病的治療將不再是醫(yī)學(xué)的難題。

［1］Dekaney CM，Rodri guez JM，GraulMC，etal.Isolation and characterization of a putativeint estinal stem cell fract i on fromm ouse j ej unum［J］.G ast roent erol ogy，2005，129（5）：1567-1580.

［2］St el zner M，Chen D C.To m ake a new i nt est i nal m ucosa［J］.Rej uvenat i on Res，2006，9（1）：20-25.

［3］Langberg CW，W al dron JA，Baker M L，et al.Si gni fi cance ofoveral lt reat m entt i m e fort he devel opm entof radi at i on i nduced i nt est i nalcom pl i cat i ons.A n experi m ent al st udy i n t he rat［J］.Cancer，1994，73（10）：2663-2668.

［4］Radt ke F，Cl evers H，Riccio0.From guthom eost asi s t o cancer［J］.Curr M ol M ed，2006，6（3）：275-289.

［5］付焱，劉志蘇，江從慶.腸道干細(xì)胞標(biāo)志物研究進(jìn)展［J］.臨床外科雜志，2010，18（1）：55-57.

［6］K aw aguchiA L，D unn JC，F(xiàn)onkal srud EW.In vi vo grow t h oft ranspl ant edgenet i cal l yal t eredi nt est i nal st em cel l s［J］.J Pedi at r Surg，1998，33（4）：559-563.

［7］K hal i lPN，W ei l er V，N el son PJ.eta1.N onm yel oabl at i ve st em cel lt herapyenhancesm i croi rcul at i onand t i ssueregenerat i oni nm uri nei nfl am m at orybow el di sease［J］.G ast roent erol ogy，2007，132（3）：944-954.

［8］魏亞明，聶玉強(qiáng)，李瑜元，等.炎癥性腸病及其干細(xì)胞移植再生修復(fù)［J］.世界華人消化雜志，2006，14（13）：1314-1317.

［9］Pot t en CS，El l i s JR.A dul t sm al l i nt est i nal st emcel l s：i dent i fi cat i on，l ocat i on，charact eri st i cs，and cl i nical appl i cat i ons［J］.Ernst Scheri ng Res Found W orkshop，2006（60）：81-98.

Effects of Intestinal Stem Cells Transplant on Dysfunction of Intestinal Mucosal Barrier after Trauma

LI Yun
Surgery Department of Nanwan People's Hospital in Longgang District，Shenzhen 518000，China

Objective：To find the method of intestinal stem cells（ISCs）in the treatment for dysfunction of intestinal mucosal barrier by observing intestinal stem cells for intestinal mucosal barrier after trauma.Methods：Intestinal epithelial stem cells were separated by fluorescence-activated cell sorting（FACS）method，the models for ISCs transplant were established by artificial frame of intestinal cavity to realize the cultivation of ISCs in vitro，ISCs cultivated in vitro could be transplanted to mouse model with radiation damage of small intestine.Results：The structures of different layers in the mucosa of rats in the normal group were normal，fine hairs were arranged in good order；the fine hairs of mucosa of rats in the model group were damaged severely，and dropped obviously；the damages of mucosa in the treatment group were less，the mucosa thickened，and returned to normal gradually.The treatment group and the model group were evaluated by RIS scale，the results demonstrated that the degree of mucosal damage in the treatment group was lower than that of the model group（P＜0.05）.Conclusion：Transplant of intestinal stem cells could promote the recovery of intestinal mucosa after the injury，and the transplant could be the new method of treating intestinal diseases.

dysfunction of intestinal mucosal barrier；intestinal stem cells；transplant

R457.7

A

1004-6852（2014）05-0009-04

2013-06-25

李云（1963—），男，碩士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：胃腸道腫瘤的診治。