盧婉怡

廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校制藥系，廣州 510663

響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取青蒿素的工藝研究

盧婉怡

廣東省食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)校制藥系，廣州 510663

目的 優(yōu)化纖維素酶提高青蒿素提取率的反應(yīng)條件。 方法 應(yīng)用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)研究酶反應(yīng)過(guò)程中時(shí)間、加酶量、溫度對(duì)提取率的影響，并對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。 結(jié)果 纖維素酶輔助提取青蒿素的最優(yōu)工藝條件：酶反應(yīng)時(shí)間2.9 h，酶添加量0.20 g，反應(yīng)溫度42.6℃。 結(jié)論 響應(yīng)面試驗(yàn)方法能夠有效提高纖維素酶輔助提取青蒿素的提取率。

青蒿素；纖維素酶；提??；響應(yīng)面

青蒿素（Artemisinin）是從菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分提取分離得到[1]，因其含有過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，使其對(duì)瘧疾具有“高效、速效、低毒”的突出療效[2]，被世界衛(wèi)生組織（WHO）稱為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。盡管青蒿素的化學(xué)合成、生物合成及組織培養(yǎng)相繼成功，但由于其產(chǎn)率低、成本高而難以投入工業(yè)化生產(chǎn)。青蒿素藥物的生產(chǎn)主要依靠從天然青蒿中提取[3]。工業(yè)化青蒿素提取方法中應(yīng)用最廣的是常規(guī)有機(jī)溶劑提取法[4]，常用溶劑包括乙醇、溶劑汽油和石油醚等[5]。由于青蒿素在黃花蒿中含量低，常規(guī)有機(jī)溶劑提取法存在提取率低、耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑消耗大等問(wèn)題[6]。近年來(lái)，一些用于天然產(chǎn)物提取的新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，如微波、超聲波和酶技術(shù)等，取得了顯著成效。其中酶技術(shù)具有反應(yīng)效率高、條件溫和、提取時(shí)間短、專一性強(qiáng)、易于控制和有效成分破壞少等優(yōu)點(diǎn)[7]，是眾多研究的熱點(diǎn)?？捎糜谳o助提取的酶的種類很多，纖維素酶是最常用的酶類之一，它能夠水解纖維素-1，4-糖苷鍵，破壞細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)，從而提高提取率，因而在中草藥有效成分的分離提取方面取得了不少成果[8]。

我國(guó)是黃花蒿的主產(chǎn)國(guó)，資源豐富，植物提取青蒿素的產(chǎn)量占全球青蒿素產(chǎn)量的90%以上。將酶技術(shù)應(yīng)用于青蒿素的提取過(guò)程，對(duì)提高青蒿素的提取效率、充分利用資源有重要意義。本研究考察了纖維素酶輔助提取青蒿素的條件，利用響應(yīng)面試驗(yàn)分析酶反應(yīng)過(guò)程各因素對(duì)提取率的影響，并優(yōu)化酶輔助提取工藝，為纖維素酶在青蒿素提取工藝上的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

FW135型中藥粉碎機(jī) （天津泰斯特儀器有限公司），752型紫外-可見分光光度計(jì)（上海菁華科學(xué)儀器有限公司）。

青蒿藥材購(gòu)于廣州市清平中藥材市場(chǎng)，經(jīng)本校張小紅講師鑒定為菊科植物黃花蒿的干燥地上部分，藥材經(jīng)粉碎后過(guò)40目篩備用。纖維素酶Cellulase T4[來(lái)源于綠色木霉（Trichoderma viride）]購(gòu)自天野酶制劑（上海）有限公司，比活力40 000 U/g（按濾紙崩解力，天野法計(jì)算）。青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品（百靈威科技有限公司，純度＞98%）。無(wú)水乙醇、95%乙醇、氫氧化鈉、乙酸和乙酸鈉等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶輔助提取青蒿素的方法 稱取1 g粉碎后的青蒿樣品置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH=4.5），先常溫下浸泡10 min，再加入一定量的纖維素酶，然后在一定溫度下水浴振蕩進(jìn)行酶反應(yīng)。酶反應(yīng)結(jié)束后抽濾，將濾餅置于100 ml具塞三角瓶中，加入50 ml無(wú)水乙醇，在45℃下水浴振蕩1 h，抽濾，取濾液測(cè)定青蒿素含量。

1.2.2 青蒿素含量的測(cè)定方法 青蒿素僅在紫外區(qū)203nm處有較弱的末端吸收，但與堿反應(yīng)后，生成一化合物Q292，該物質(zhì)在292 nm處有最大吸收，可用紫外分光光度法檢測(cè)[9]。取樣品溶液0.5 ml加入95%乙醇4.5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測(cè)定吸光值，每組測(cè)定三個(gè)平行樣品，取平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出青蒿素含量。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)是通過(guò)對(duì)響應(yīng)面等值線的分析，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的一種統(tǒng)計(jì)方法。具有試驗(yàn)次數(shù)少、精度高等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)還能夠?qū)Ω饕蜃拥慕换プ饔眠M(jìn)行評(píng)價(jià)，快速有效的確定最佳條件。其中包括多種設(shè)計(jì)方法，本研究利用Designexpert 7.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)與分析，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)采用中心組合設(shè)計(jì)。中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)中每種因素取5種水平，以（-α、-1、0、1、α）編碼（本實(shí)驗(yàn)中α=1.414）。本實(shí)驗(yàn)選取酶反應(yīng)時(shí)間（A）、酶反應(yīng)溫度（B）和酶添加量（C）作為影響因素，中心組合實(shí)驗(yàn)的編碼和水平見表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)的編碼及水平

2 結(jié)果

2.1 青蒿素含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確稱取青蒿素標(biāo)準(zhǔn)樣品10 mg，溶于95%乙醇溶液，定容至100 ml容量瓶中，配制成0.1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5 ml，加95%乙醇溶液至5 ml，再加入0.2%NaOH 20 ml定容至25 ml，50℃水浴加熱30 min，取出快速冷卻，在292 nm處測(cè)定吸光值，每組取三個(gè)平行樣品，取平均值。以青蒿素樣品濃度x（g/L）為橫坐標(biāo)，292 nm吸光值y為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果得線性方程為D292=1.065c+0.019（r2=0.9971）。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用Designexpert 7.0軟件設(shè)計(jì)的中心組合實(shí)驗(yàn)數(shù)n=12，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果如表2所示，實(shí)驗(yàn)次序?yàn)殡S機(jī)安排。

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)中心組合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果在Designexpert 7.0軟件中進(jìn)行方差分析（ANOVA），結(jié)果表明，模型的P=0.0096，表明模型顯著。對(duì)因素的交互效應(yīng)分析表明，A、C、BC 和A2為顯著影響因素，即酶反應(yīng)時(shí)間、加酶量、酶反應(yīng)溫度與加酶量交互作用和反應(yīng)時(shí)間的平方值為顯著影響因素。模型相關(guān)系數(shù)r2=0.9979，表明模型在99.79%程度上能夠解釋酶輔助提取率與變量之間的關(guān)系。模型的校正相關(guān)系數(shù)Adj r2=0.9882，與r2的數(shù)值相接近表明模型預(yù)測(cè)值和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的相關(guān)性。模型的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為2.58%，表明模型的可信任程度高。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析導(dǎo)出模型的二次方程：提取率R=2.34+0.19×A-0.042×B+0.70×C+0.15×A×B-0.035× B×C+0.17A2+0.031×B2-0.077×C2。利用Designexpert 7.0軟件得出模型預(yù)測(cè)最大值為3.24，此時(shí)酶反應(yīng)時(shí)間為 2.94 h，酶反應(yīng)溫度為 42.62℃，酶添加量為0.199 g。對(duì)模型的預(yù)測(cè)值進(jìn)行驗(yàn)證，取酶反應(yīng)時(shí)間2.9 h，酶反應(yīng)溫度42.6℃，酶添加量0.2 g，進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，得到青蒿素提取率的平均值為3.27 mg/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的提取率與預(yù)測(cè)值基本吻合，表明優(yōu)化模型能夠很好地說(shuō)明酶反應(yīng)各因素與提取率之間的關(guān)系。與未采用酶輔助提取時(shí)的提取率1.13 mg/g相比，優(yōu)化后酶輔助提取青蒿素的方法提高了1.89倍，表明酶輔助提取能有效提高青蒿素的提取率。

3 討論

青蒿素主要存在與青蒿植物的莖葉組織中[2]，試驗(yàn)結(jié)果顯示，纖維素酶Cellulase T4作用于青蒿能夠提高其中青蒿素的提取率，表明恰當(dāng)?shù)乩美w維素酶處理能夠克服植物組織中纖維素的屏障作用，利于有效成分的溶出[10]。影響纖維素酶水解植物細(xì)胞壁反應(yīng)的主要因素包括酶用量、酶反應(yīng)溫度和酶反應(yīng)時(shí)間等[10]，本研究利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，并對(duì)酶輔助提取青蒿素工藝中各顯著影響因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化條件下青蒿素的提取率較未使用酶輔助提取工藝提高了1.89倍。本研究將纖維素酶應(yīng)用于青蒿素輔助提取方面，顯著提高了青蒿素的提取率，為酶技術(shù)在中藥制藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用提供了參考。

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Optimization of cellulase assisted extraction of artemisinin from Artemisia annua L.by response surface method

LU Wan-yi
Deptment of Pharmaceutics,Guangdong Food and Drug Vocational-technical School,Guangzhou 510663,China

ObjectiveTo optimize the factors affecting the yield of Artemisinin extracted from Artemisia annua L.by using cellulose assisted extraction.MethodsOptimization experiments were conducted by using central composite design of response surface method.The inter-effections of main factors included reaction time,cellulose dose and temperature were also studied.ResultsCellulose enzyme assisted extraction of Artemisinin,the optimal process conditions:the enzyme reaction time 2.9 h,cellulose dose 0.20 g and temperature 42.6℃.ConclusionThe yield of cellulose assisted extraction of Artemisinin extracted from Artemisia annua L.could be improved by using response surface method.

Artemisinin;Cellulase;Extraction;Response surface method;Optimization

R94

A

1674-4721（2014）01（a）-0004-03

2013-09-10本文編輯：林利利）

盧婉怡（1977-），女，工程師，生物工程碩士，籍貫：廣州；從事生物技術(shù)研發(fā)及教學(xué)