孫勇，李運輝，張鵬

(萊蕪市人民醫(yī)院普外科，山東萊蕪 271100)

·論著·

BRCA1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)抑癌作用研究

孫勇，李運輝，張鵬

(萊蕪市人民醫(yī)院普外科，山東萊蕪 271100)

目的研究BRCA1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌組織中的抑癌作用。方法甲基化PCR法檢測60例乳腺癌患者的癌組織、癌旁組織和20例乳腺良性組織中BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，以及評價其作用。結果癌組織和癌旁組織中BRCA1-mRNA的表達水平分別為(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，在癌組織、癌旁組織、良性腫瘤組織中BRCA1表達的甲基化率分別為70.0%、48.3%、35.0%。癌組織的甲基化率明顯的高于癌旁組織和良性腫瘤組織；經統(tǒng)計學分析顯示，淋巴結轉移、腫瘤分級在BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化中的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，絕經、組織分型在BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化中的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且與組織分期和淋巴結的轉移密切相關。

乳腺癌；BRCA1基因表達；啟動子區(qū)；甲基化

乳腺癌是臨床上常見的女性惡性腫瘤之一，乳腺癌的發(fā)展是一個多因素、多階段的綜合過程。目前，臨床上對乳腺癌的研究報道較多，對其病因的研究已經有一定的了解[1]。BRCA1是卵巢癌和乳腺癌特異性抑癌基因，其在細胞周期傳導信號的過程中具有十分重要的作用。在正常的卵巢組織和乳腺中該基因會正常表達，而在卵巢癌或乳腺癌中則會缺失或下降[7]。本文旨在研究BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌組織中的抑癌作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院普外科2007年6月至2013年6月住院的60例乳腺癌患者，年齡35～75歲，平均(55±11.797)歲。經病理學診斷，侵入性導管癌40例、鱗狀上皮癌10例、浸潤小葉癌5例、葉囊性肉瘤5例，同時選取我院乳腺檢查正常的乳腺良性組織20例。用電泳法提取乳腺癌患者血液組織中DNA，用分光光度儀定量后，在-20℃保存待用。

1.2 診斷及排除標準所有患者均符合乳腺癌篩查規(guī)范化診斷標準和操作方法的乳腺癌臨床診斷標準以及符合倫理道德，家屬或者患者簽署了知情同意書等。排除標準[3]：①患有其他重要的器官衰竭性疾病，或者內分泌性疾病，比如肝腎衰竭、糖尿病等；②正在服用可能影響研究效果和結局藥物的患者；③具有嚴重神經精神疾病的、意識不清不能參加隨訪的患者。剔除標準[4]：①凡對試驗的調查研究不依從、不配合、容易產生失訪的以及拒絕參加試驗者都應剔除；②試驗過程中不按照規(guī)定進行檢查，或者在調查過程中采用了其他治療措施的可能影響試驗結果的；③在治療過程中病情突然加重不能再參加試驗的。

1.3 研究方法

1.3.1 BRCA1-mRNA表達水平的檢測(1)RNA提取：選擇FASTAGEN-RNAFAST200試劑盒(由飛捷生物公司生產)提取組織中的RNA，利用紫外分光光度法對RNA的純度和濃度進行測定，放在溫度為-20℃的恒溫箱里保存。（2）RT-PCR的檢測：對RNA進行逆轉錄。用半定量PCR擴增cDNA，PCR是25 L反應體系，反應條件包括：①內參照94℃4 min，72℃30 s，55℃30 s，共循環(huán)30次。②BRCIA：94℃5 min，52℃30 s，72℃30 s，55℃30 s，72℃7 min，共循環(huán)30次。

1.3.2 BRCA1基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)(1) DNA的提?。翰捎梅?氯仿手工法提取組織中的DNA，利用紫外分光光度法對RNA的純度和濃度進行測定，放在溫度為-20℃的恒溫箱里保存。(2)基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾：將DNA 2 μl置于1.5 ml EP管中，稀釋至50 μl，加苯二酚10 mmol/L和亞硫酸氫鈉3.6 mol/L，容易避光、均勻混合，并加200 μl石蠟油，避免氧化和水分蒸發(fā)，在50℃的條件下，水浴16 h。

1.4 觀察指標BRCA1-mRNA表達在各種細胞中表達水平；BRCA1-mRNA表達的下降率；甲基化率。在不同的組織分級、有無轉移、絕經、激素受體(ER)、孕激素受體(PR)中BRCA1-mRNA表達的差異情況。

1.5 統(tǒng)計學方法應用SPSS13.0軟件進行數據分析，計量資料以均值±標準差()表示，對于符合正態(tài)分布，方差齊性的資料應用兩組之間的t檢驗，對于符合條件的多個均值之間的比較應用方差分析；計數資料采用百分比表示，應用χ2檢驗，χ2檢驗三者之間有意義后，再采用SNK-q檢驗進行兩兩之間的比較。檢驗水準取α=0.05，當P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BRCA1-mRNA在不同細胞中的表達經過PCR分析后癌組織和癌旁組織中BRCA1-mRNA的表達水平分別是(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，而在乳腺良性腫瘤的組織中表達水平是(0.996 5±0.045 0)，明顯高于癌組織和癌旁組織，統(tǒng)計學檢驗后，其差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖1。

圖1 BRCA1-mRNA在癌組織、癌旁組織、良性腫瘤的表達水平

2.2 三種乳腺組織BRCA1表達的甲基化率比較癌組織、癌旁組織、良性腫瘤組織BRCA1表達的甲基化率分別為70.0%、48.3%、35.0%。癌組織的甲基化率明顯高于癌旁組織和良性腫瘤組織。三者甲基化率經過χ2檢驗，差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=9.766，P=0.008)，再經過兩兩比較，癌組織與癌旁組織之間差異無統(tǒng)計學意義(χ2=5.829，P=0.016)，而癌組織和良性組織之間差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=7.742，P= 0.005)，見表1。

表1 三種乳腺組織中BRCA1表達的甲基化比較（例）

2.3 乳腺癌組織中BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與病理指標的相關性經統(tǒng)計學分析，淋巴結轉移、腫瘤分級在BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化中的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，絕經、組織分型在BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化中的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 乳腺癌組織中BRCA1基因啟動子區(qū)甲基化與病理指標的相關性

3 討論

乳腺癌是乳腺上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤，超過了99%的乳腺癌患者為女性。目前臨床上對乳腺癌的發(fā)病機制研究結果尚未明確，有研究表明，乳腺癌的發(fā)生具有一定的規(guī)律性，其中，乳腺癌家族史、月經初潮過早等是乳腺癌發(fā)病的高危因素[5]。通常情況下乳腺癌沒有明顯的臨床表現，不容易引起患者的重視，往往在乳腺癌篩查或體檢的時候才會發(fā)現。BRCA1基因是卵巢癌和乳腺癌特異性的一種抗癌基因，基因的改變和卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。在乳腺癌組織中，關于BRCA1基因突變的報道較少，基因的雜合性丟失頻率也較低。近年來，國內外大部分研究發(fā)現[6]，在卵巢癌或乳腺癌中BRCA1有較高的甲基化頻率，且該基因的異?；淖冎辉诼殉舶┖腿橄侔┲杏凶兓?，而在肝癌、結腸癌、食管癌以及白血病等惡性腫瘤中均不發(fā)生甲基化。Deshmukh等[7]用甲基化特異性檢測法MSP對乳腺癌的引流液進行檢查，結果顯示BRCA1啟動子區(qū)異常甲基化的頻率達到了39%。另有謝飛等[8]對20例乳腺癌患者BRCA1中CPG島中的30個CPG位點的基因轉錄水平和甲基化情況進行研究，結果證實CPG島甲基化和抑制基因轉錄有著密切的關系。

BRCA1基因在正常卵巢組織和乳腺癌上皮組織中高表達，臨床上對BRCA1-mRNA表達水平降低的原因主要以基因突變、啟動子區(qū)甲基化以及雜合性丟失。目前，國內用RT-PCR檢測乳腺癌組織中的BRCA1-mRNA表達水平尚沒有明確報道。湯靚等[9]用RT-PCR檢測法表明，BRCA1-mRNA在乳腺癌上皮組織中及癌旁正常組織中的表達均明顯低于乳腺良性組織中的表達。在組織分級中，分級越低BRCA1-mRNA的表達下降率越低，而分級率越高其表達率也隨之升高，其中T3的下降率達到了60%。此外，有淋巴結轉移的乳腺癌組織中該基因的表達下降率為39%[10]，無淋巴結轉移的乳腺癌組織中，BRCA1-mRNA的表達下降率為28%，表明BRCA1-mRNA的表達下降與有無淋巴結轉移密切相關。但是BRCA1-mRNA的表達與絕經、P53，腫瘤組織分型等無關[10]。

本研究通過對60例乳腺癌組織中BRCA1-mRNA組織中BRCA1和mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)進行檢測，結果顯示，癌組織和癌旁組織中BRCA1-mRNA的表達水平分別是(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，癌組織、癌旁組織、良性腫瘤組織BRCA1表達的甲基化率分別為70.0%、48.3%、 35.0%。癌旁組織的甲基化鋁明顯的高于癌旁組織和良性腫瘤組織；經過檢驗淋巴結轉移、腫瘤分級在BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化差異有統(tǒng)計學意義，絕經、組織分型在BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化中比較差異有統(tǒng)計學意義。這一結果提示BRCA1-mRNA的表達水平在正常乳腺癌組織中沒有異常變化，而在乳腺癌組織中明顯降低，且與淋巴結的轉移和組織分型相關。

對BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌組織中抑癌作用的研究，有助于對乳腺癌中抑癌基因失活的遺傳學機制進行充分闡明。DNA甲基化的改變具有乳腺癌腫瘤細胞的特異性，甲基化的表型在惡性表型出現之前，因此，在確診腫瘤之前，可以對甲基化陽性的抑癌基因進行檢測。

綜上所述，BRCA1-mRNA表達及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且與組織分期和淋巴結的轉移密切相關，這一結果對乳腺癌的臨床診斷的治療具有重要參考價值。

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Effect of BRCA1 promoter methylation on tumor inhibition.

SUN Yong,LI Yun-hui,ZHANG Peng.
Department of General Surgery,Laiwu People's Hospital,Laiwu 271100,Shandong,CHINA

>ObjectiveTo study the effect of BRCA1 promoter methylation on tumor inhibition in breast cancer tissue.MethodsBRCA1-mRNA expression and promoter methylation were detected by methylation PCR in 60 cases of breast cancer tissue,pericarcinous tissue,and 20 cases of benign mammary gland tissue.Meanwhile,its effect was evaluated.ResultsThe expression of BRCA1-mRNA levels in the cancer tissue and pericarcinous tissue were(0.612 2±0.234 4)and(0.234 4±0.257 6),respectively.The methylation rate in cancer tissure,pericarcinous tissue and benign tumor tissue were 70.0%,48.3%and 35.0%,respectively.And the methylation rate in cancer tissue was significantly higher than those in pericarcinous tissue and benign tumor tissue.The differences of lymph node matastasis and tumor classification in BRCA1 mRNA expression and promoter methylation were statistically significant (P＜0.05),while there was no difference in menopause and histological stages in BRCA1 mRNA expression and promoter region methylation(P＞0.05).ConclusionBRCA1 mRNA expression and promoter region methylation status play an important role in the development of breast cancer,and are closely related to the histological stages and lymph node metastasis.

Breast cancer;BRCA1 gene expression;The promoter region;Methylation

R737.9

A

1003—6350（2014）12—1717—03

2013-12-18)

山東省自然科學基金（編號：009ZRB14999)

孫勇。E-mail：fl81955664703@163.com