洪良利，秦杰升，黃杰雄，邱前程，董恒

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科1、耳鼻喉頭頸外科2，廣東汕頭515041)

·臨床病理·

NF-κB p65、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及意義

洪良利1，秦杰升2，黃杰雄1，邱前程1，董恒1

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科1、耳鼻喉頭頸外科2，廣東汕頭515041)

目的探討NF-κBp65、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)及意義。方法采用免疫組化EnVision兩步法檢測257例PTC及癌旁甲狀腺組織中的NF-κBp65、CyclinD1表達(dá)水平，并分析二者表達(dá)水平的變化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果(1)NF-κBp65、CyclinD1在PTC組織中的陽性率分別為58.8%(151/257)及89.9%(231/257)，均顯著高于癌旁正常甲狀腺組織(P＜0.01)；(2)NF-κBp65、CyclinD1的表達(dá)水平與腫瘤大小、病灶數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，與性別及年齡無關(guān)；(3)NF-κBp65與CyclinD1的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。結(jié)論NF-κBp65、CyclinD1的異常表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后有密切聯(lián)系，聯(lián)合檢測二者表達(dá)水平可作為判斷PTC生物學(xué)行為及預(yù)后指標(biāo)，并為其新靶點治療提供依據(jù)。

NF-κB p65；CyclinD1；甲狀腺乳頭狀癌

甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid carcinoma，PTC)是頭頸部最常見的惡性腫瘤，占甲狀腺惡性腫瘤的70%～85%[1]。大多數(shù)PTC經(jīng)手術(shù)切除及放射性131I的治療，預(yù)后良好，但由于PTC早期即易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，而現(xiàn)有對PTC預(yù)后的臨床評分指標(biāo)(包括性別、甲狀腺功能、腫物大小、多灶性、血管、甲狀腺外組織侵犯等)均不能精確判斷出生物學(xué)行為上具有較高侵襲性及轉(zhuǎn)移能力的PTC，所以對PTC的發(fā)病機(jī)制和生物學(xué)行為的研究顯得尤為重要。核因子-κB p65 (NF-κBp65)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點，激活后可與相關(guān)基因啟動子或增強子特殊DNA序列(κB位點)結(jié)合，通過調(diào)控其下游靶基因如細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1等的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[2]。

本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常甲狀腺組織中NF-κBp65和CyclinD1的表達(dá)，探討它們在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用及兩者間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2007年6月至2013年6月經(jīng)手術(shù)切除的257例甲狀腺乳頭狀癌及對應(yīng)癌旁正常甲狀腺組織存檔蠟塊，每例臨床資料完整。其中男性57例，女性200例。年齡17～79歲，中位年齡44歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及免疫制劑等抗癌治療。

1.2 試劑本實驗中所用一抗NF-κ B p65 (sc-8008)購自美國Santa Cruz公司，實驗抗體使用濃度為1:100；CyclinD1均購自福建邁新公司，為即用型工作濃度。二抗及DAB顯色試劑均購自福州邁新公司。

1.3免疫組化染色及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)采用En-Vision二步法，由試劑公司提供陽性對照片，分別以乳腺癌、套細(xì)胞淋巴瘤組織作為NF-κB p65、CyclinD1的陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，操作嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。NF-κB p65染色結(jié)果以胞漿和(或)胞核棕黃染色者為陽性細(xì)胞，無棕黃染色者為陰性；CyclinD1以胞核棕黃染色者為陽性細(xì)胞。參照Francesco等的判定標(biāo)準(zhǔn)[3]：0分，無陽性著色；1分，陽性細(xì)胞＜10%；2分，陽性細(xì)胞介于10%～50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)＞50%；根據(jù)染色程度分為:無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；兩項結(jié)果相加：總分＜2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6～7分為強陽性(+++)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行分析，組間率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。檢驗標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 NF-κBp65、CyclinD1在甲狀腺乳頭狀癌及癌旁正常甲狀腺組織中的表達(dá)NF-κBp65在PTC組織中出現(xiàn)胞漿表達(dá)增強，其中151例(59%)出現(xiàn)少量胞核/核周異位陽性表達(dá)，在癌旁正常甲狀腺組織濾泡上皮中僅表現(xiàn)為胞漿弱陽性(見圖1)，未見核陽性表達(dá)；CyclinD1在PTC組織中231例(90%)出現(xiàn)核陽性過表達(dá)，在癌旁正常甲狀腺組織中未檢測到表達(dá)或個別病例出現(xiàn)低表達(dá)(陽性細(xì)胞＜5%)，見圖2。

圖1 NF-κB p65在癌旁正常甲狀腺組織表現(xiàn)為胞膜/胞漿弱陽性，在甲狀腺乳頭狀癌組織中細(xì)胞漿表達(dá)增強伴少量胞核/核周異位陽性表達(dá)(EnVision二步法，200倍)

2.2 癌組織中NF-κB p65、CyclinD1表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系NF-κB p65、CyclinD1的異常高表達(dá)率在PTC組織中的表達(dá)水平與腫瘤大小、病灶數(shù)目、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高病理分期有關(guān)，但與性別及年齡無關(guān)(P＞0.05)。直徑大于1 cm的癌表達(dá)率高于直徑小于1 cm的微小癌；多發(fā)病灶組高于單發(fā)病灶組；有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于無轉(zhuǎn)移組；高臨床病理分期(Ⅲ～Ⅳ期)組高于低臨床病理分期組(Ⅰ～Ⅱ期)，見表1。

圖2 CyclinD1在PTC中彌漫核強陽性，癌旁正常甲狀腺組織未見表達(dá)(EnVision二步法，200倍)

表1 NF-κB p65、CyclinD1表達(dá)與PTC臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

2.3 甲狀腺乳頭狀癌中NF-κB p65的表達(dá)與CyclinD1之間的相互關(guān)系NF-κBp65的表達(dá)與CyclinD1陽性表達(dá)之間呈正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。在151例NF-κBp65陽性標(biāo)本中，有142例同時存在CyclinD1過表達(dá)；而在28例CyclinD1陰性標(biāo)本中有19例伴NF-κBp65表達(dá)缺失，相關(guān)分析證實，甲狀腺乳頭狀癌組織中NF-κBp65與CyclinD1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.412，P＜0.01)，見表2。

表2 甲狀腺乳頭狀癌中NF-κB p65的表達(dá)與CyclinD1之間的相互關(guān)系(例)

3 討論

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κBp65是哺乳動物組織中一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在刺激因素作用下，胞漿中的NF-κ Bp65被激活，逆移入核后與相關(guān)基因啟動子或增強子特殊DNA序列(κB位點)結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因蛋白的表達(dá)，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞如白血病、淋巴瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等的細(xì)胞增殖，抗凋亡、促血管生成及轉(zhuǎn)移作用[2，4-6]。體外細(xì)胞學(xué)研究表明，在甲狀腺乳頭狀癌、濾泡癌和未分化癌細(xì)胞株中存在NF-κB活化水平的升高，并且與甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力相關(guān)。也有研究表明甲狀腺乳頭狀癌組織中存在NF-κB的激活，但卻沒有探討其臨床病理意義[3，6]。在本研究中，NF-κB p65在PTC細(xì)胞漿中的表達(dá)較癌旁正常甲狀腺組織明顯增強58.8%(151/257)病例出現(xiàn)少量核或核周表達(dá)。NF-κB p65陽性表達(dá)與腫瘤大小、病灶數(shù)目、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高臨床病理分期有關(guān)。因此提示，NF-κBp65的異常激活在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中均起了一定作用。

細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1是細(xì)胞周期的正性調(diào)控因子，目前認(rèn)為是一種原癌基因，其過表達(dá)可縮短G1期，加快細(xì)胞進(jìn)入S期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，CyclinD1在PTC組織中陽性率高達(dá)90%，與腫瘤大小、病灶數(shù)目、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高臨床病理分期呈正相關(guān)，而與年齡及性別無關(guān)。提示CyclinD1的異常過表達(dá)同樣不僅參與甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。

CyclinD1同時作為NF-κB p65的重要靶基因，其啟動子上含有兩個與NF-kB結(jié)合的位點，NF-κB的活化可導(dǎo)致CyclinD1過表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究中，151例NF-κBp65陽性PTC中CyclinD1有82例過表達(dá)，NF-κBp65與CyclinD1的表達(dá)成正相關(guān)關(guān)系(P＜0.01)。推測NF-κBp65的激活可能通過調(diào)控下游CyclinD1的過度表達(dá)，參與PTC的細(xì)胞增殖，侵襲及轉(zhuǎn)移，但其確切機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，NF-κBp65的激活及CyclinD1的過表達(dá)在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展侵襲及轉(zhuǎn)移中起了一定作用，提示NF-κBp65可能作為PTC治療新靶點。臨床病理診斷中對手術(shù)切除PTC組織及術(shù)前甲狀腺腫物細(xì)針穿刺組織進(jìn)行NF-κBp65、CyclinD1的檢測，可以作為早期診斷甲狀腺乳頭狀癌、幫助判斷甲狀腺乳頭狀癌患者是否需要進(jìn)行頸部淋巴結(jié)清掃及判斷PTC患者預(yù)后的指標(biāo)，并且為新靶點治療提供依據(jù)。

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Expression of NF-kB p65,CyclinD1 in papillary thyroid carcinoma and its significance.

HONG Liang-li1,QIN Jie-sheng2,HUANG Jie-xiong1,QIU Qian-cheng1，DONG Heng1.
Department of Pathology1,Depertment of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery2,The First Affiliated Hospital of Shantou University Medical College, Shantou 515041,Guangdong,CHINA

>ObjectiveTo investigate the expression of nuclear factor kappaB(NF-kB)p65 and CyclinD1 in papillary thyroid adenocarcinoma(PTC)and its clinical significance.MethodsWe investigated the expression of NF-kB p65,CyclinD1 in 257 cases of papillary thyroid adenocarcinoma and normal thyroid tissues by immunohistochemical technique.Results(1)The expression of NF-kB p65 and CyclinD1 in PTC is significantly higher than that in the normal thyroid tissues(P＜0.01).(2)The aberrant expression rates of NF-kB p65 and CyclinD1 in PTC were closely related to tumor size,numbers of lesion,lymph node metastasis and clinicopathological stage but did not show correlation with age and gender.(3)There was a significant positive correlation between NF-kB p65 and CyclinD1(P＜0.01).ConclusionNF-kB p65 and CyclinD1 may play roles in the occurrence and development of PTC.It is possible to use a joint test of NF-kB p65 and CyclinD1 in identifying the disease and providing a prognosis.

NF-kB p65;CyclinD1;Thyroid papillary;Adenocarcinoma

R736.1

A

1003—6350（2014）12—1853—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.12.0721

2014-01-24)

洪良利。E-mail：hong_liangli@163.com