馬磊，伍思培，鄧旭斌，金川，陸勤，劉曉燕，陳文晟，鄒青峰

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510095；2.廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所，廣東 廣州 510080）

·論著·

D-CIK治療抑制進(jìn)展期乳腺癌中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的初步研究

馬磊1，伍思培2，鄧旭斌1，金川1，陸勤1，劉曉燕1，陳文晟1，鄒青峰1

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)三科廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所，廣東 廣州 510095；2.廣東省人民醫(yī)院肺癌研究所，廣東 廣州 510080）

目的探討D-CIK治療對(duì)進(jìn)展期乳腺癌外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)的變化情況及意義。方法采用Cellsearch檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)32例明確診斷為進(jìn)展期乳腺癌患者分別在CIK細(xì)胞回輸治療前后檢測(cè)外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)目變化情況，同時(shí)觀察治療過(guò)程中患者的相關(guān)不良反應(yīng)。結(jié)果患者接受D-CIK治療后，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目明顯減少，由治療前的5～18個(gè)/7.5 ml減少為治療后的2～11個(gè)/7.5 ml，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P＜0.05)。治療過(guò)程中未見(jiàn)明顯不良反應(yīng)。結(jié)論D-CIK治療可明顯降低患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的數(shù)目。

D-CIK；乳腺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞

乳腺癌是危害人類(lèi)健康的高發(fā)惡性腫瘤，不論是在發(fā)達(dá)國(guó)家還是在我國(guó)，均為女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤類(lèi)型。在我國(guó)目前乳腺癌的發(fā)病率為41.64/10萬(wàn)，死亡率為9.63/10萬(wàn)[1]；在美國(guó)2013年一共有232 340例新發(fā)乳腺癌病例，39 620例死亡病例[2]。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，尤其是早期檢測(cè)手段的實(shí)施和整體治療方案的更新，總體死亡率在近年來(lái)呈現(xiàn)進(jìn)行性下降趨勢(shì)，但是對(duì)于伴有復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤患者，生存狀況并沒(méi)有得到根本的改善。腫瘤一旦發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，疾病將很難治愈，并最終導(dǎo)致絕大多數(shù)死亡[3]。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個(gè)包含多個(gè)步驟的復(fù)雜病理過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞的脫落、穿透基底膜、進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)、繼發(fā)部位克隆形成并最終形成臨床可見(jiàn)的轉(zhuǎn)移瘤。其中腫瘤細(xì)胞從癌癥原發(fā)部位脫落，通過(guò)血管或淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)是整個(gè)轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前研究證實(shí)，在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，可以在患者的外周血中檢測(cè)到循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells，CTCs)。在多種實(shí)體瘤中，CTCs可以反映腫瘤負(fù)荷，預(yù)測(cè)疾病發(fā)展，協(xié)助治療決策，比傳統(tǒng)影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)更為準(zhǔn)確和靈敏，重復(fù)性更佳。因而它的診斷和治療價(jià)值以及在轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的作用越來(lái)越受到科學(xué)家們的重視[4]。因?yàn)镃TCs經(jīng)常保持在未分化的狀態(tài)，甚至有些保持在干細(xì)胞的狀態(tài)，因此對(duì)常規(guī)的化療和靶向治療并不敏感。如何發(fā)展出特異性靶向CTCs的治療手段，減少或者消除外周循環(huán)中CTCs的含量，阻滯腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程，最終降低腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，提高最終治療效果，延長(zhǎng)患者總體生存時(shí)間具有重要的臨床意義[5]。本次研究中，筆者試圖采用Cellsearch檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)D-CIK治療前后患者外周血循環(huán)中CTCs數(shù)量的變化，初步探討D-CIK細(xì)胞免疫療法對(duì)CTCs的抑制作用。

1 資料與方法

1.1 入組標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過(guò)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)證實(shí)的乳腺癌患者；年齡≤75歲；既往曾經(jīng)使用過(guò)包括手術(shù)及放化療在內(nèi)的綜合治療，均有客觀臨床觀察指標(biāo)；末次放化療結(jié)束至少1個(gè)月，近1個(gè)月內(nèi)未作過(guò)其他抗腫瘤治療；無(wú)腦轉(zhuǎn)移及嚴(yán)重心功能不全；肝腎功能及血象基本正常，KPS＞70分，預(yù)計(jì)生存3個(gè)月以上；所有患者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 臨床資料共計(jì)55例2012年6月至2014年2月于我院門(mén)診及住院的接受免疫D-CIK治療晚期乳腺癌患者進(jìn)行了CTCs檢測(cè)。其中32例患者在治療前檢測(cè)中CTCs檢出率為58.2%。檢測(cè)到CTCs的32例患者全部納入到本次研究，見(jiàn)表1。

表1 32例患者的臨床資料[例（%）]

1.3 研究方法

1.3.1 D-CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增與回輸整個(gè)操作均在本單位生物層流室完成。首先采集患者外周血100 ml，使用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)分離和收集單個(gè)核細(xì)胞。將細(xì)胞接種在1640完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞終濃度大于106/ml。經(jīng)過(guò)37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后收集懸浮細(xì)胞作為效應(yīng)T細(xì)胞培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞為DC細(xì)胞。后續(xù)培養(yǎng)第3天加入AIM-V培養(yǎng)液(含GM-CSF 800 U/ml)，第4天加入IL-4 1 000 U/ml，第6天加入TNF-α(100 IU/ml)刺激成熟，第7天檢測(cè)DC表型，合格后與CIK細(xì)胞共培養(yǎng)。至14 d收集細(xì)胞獲得D-CIK細(xì)胞，檢測(cè)合格后進(jìn)行細(xì)胞回輸治療。

1.3.2 循環(huán)中腫瘤細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè)采用CellSearch系統(tǒng)專(zhuān)用CellSave管，分別于治療前和治療后第4周抽取患者外周血，經(jīng)過(guò)離心后，在CellTracks自動(dòng)反應(yīng)儀中進(jìn)行系列免疫反應(yīng)，接著在磁槽中進(jìn)行孵化，最后由CellTracks自動(dòng)分析儀掃描和分析結(jié)果。采樣后72 h內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)，每次檢測(cè)需至少含一次質(zhì)控品。

1.3.3 不良反應(yīng)的處理觀察D-CIK回輸過(guò)程中患者發(fā)生的不良反應(yīng)，并及時(shí)給予對(duì)癥處理措施。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSSl0.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D-CIK治療前后患者CTCs變化情況每例乳腺癌患者在接受D-CIK治療前后，分別采用Cellsearch檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)CTCs的數(shù)目。在治療前患者CTCs的數(shù)量為5～18個(gè)/7.5 ml；治療后數(shù)量減少為2～11個(gè)/7.5 ml，每例患者的具體數(shù)值變化見(jiàn)表2。采用配對(duì)t檢驗(yàn)方法對(duì)比D-CIK治療前后CTCs的數(shù)目。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)D-CIK治療后，CTCs的數(shù)量與治療前相比較明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(t= 13.998，P=0.000)。

2.2 不良反應(yīng)整個(gè)治療過(guò)程中均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)者，3例患者出現(xiàn)輕度發(fā)熱，1例患者出現(xiàn)上肢皮疹，經(jīng)對(duì)癥處理后迅速緩解。

表2 D-CIK治療前后患者CTCs變化情況

3 討論

早在19世紀(jì)中葉已經(jīng)有研究者提出循環(huán)腫瘤細(xì)胞的概念，但是由于科學(xué)技術(shù)手段的局限，對(duì)CTCs的研究一直停留在原始水平。近來(lái)隨著科技的發(fā)展，已經(jīng)發(fā)展出多種手段來(lái)檢測(cè)及鑒定CTCs，包括Cellsearch系統(tǒng)，已經(jīng)在敏感性和穩(wěn)定性方面得到了充分的驗(yàn)證，并得到FDA的批準(zhǔn)[6]。關(guān)于CTCs的臨床研究在多種腫瘤中已經(jīng)得到進(jìn)行，如在關(guān)于乳腺癌的前瞻性多中心雙盲臨床試驗(yàn)中，共納入177例患者。分別于治療前、治療開(kāi)始后3～5周、6～8周、9～14周、15～20周數(shù)個(gè)不同階段進(jìn)行CTCs水平檢測(cè)。結(jié)果顯示治療前CTCs高水平者預(yù)后較差，與低水平者比較，無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(Progression-free survival，PFS)為2.7個(gè)月和7.0個(gè)月?？偵嫫?Overall survival，OS)為10.9個(gè)月和18.5個(gè)月。在治療過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果具有同樣的趨勢(shì)。筆者認(rèn)為不論在治療的任何時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行CTCs的檢測(cè)，對(duì)之后的病情變化均有準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)作用[7]。歐洲腫瘤研究院把CTC的數(shù)量作為連續(xù)變量進(jìn)行研究，平均隨訪時(shí)間達(dá)到28個(gè)月。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著CTCs細(xì)胞數(shù)量的增高，PFS和OS呈現(xiàn)連續(xù)非線性的下降趨勢(shì)，這種相關(guān)性直到數(shù)量大于5個(gè)以后才逐漸減弱[8]。在結(jié)腸癌的前瞻性多中心研究中，共納入430例患者，分別在初始治療前，一線、二線、三線治療后進(jìn)行CTCs的檢測(cè)。結(jié)果顯示治療前CTCs高水平者預(yù)后較差，與低水平者比較PFS為4.5個(gè)月和7.9個(gè)月，OS為9.4個(gè)月和18.5個(gè)月。即使在不良預(yù)后組，如果在治療過(guò)程中循環(huán)腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少至3個(gè)以下，也比治療過(guò)程中細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有明顯減少的為好，兩者比較，PFS為6.2個(gè)月和1.6個(gè)月，OS為1.0個(gè)月和3.7個(gè)月。筆者認(rèn)為CTCs數(shù)量多少是PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因素，并且在治療過(guò)程中對(duì)治療效果有預(yù)測(cè)作用[9]。

CTCs對(duì)腫瘤進(jìn)程的不利影響可能與其所具有的表皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)和腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)的表型相關(guān)。有研究證實(shí)，在CTCs檢測(cè)陽(yáng)性的乳腺癌臨床標(biāo)本中，有97%表達(dá)Twist1、Akt2、PI3Kalpha三個(gè)重要EMT標(biāo)志中的至少一個(gè)，而且有95%表達(dá)ALDH1這一重要的CSC標(biāo)志。而在CTCs檢測(cè)陰性的標(biāo)本中這些標(biāo)志的表達(dá)極為低下[10]。采用Twist和Vimentin這兩個(gè)指標(biāo)組合得到類(lèi)似的結(jié)果，即使是在早期乳腺癌患者[11]。采用紫杉醇這些常用化療藥物處理乳腺癌細(xì)胞，除殺傷腫瘤細(xì)胞這一作用外，反而有可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制包括對(duì)微管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[12]。由于這些特殊表型，常規(guī)的化療和靶向治療并不能產(chǎn)生針對(duì)CTCs的治療效果，甚至還可能促進(jìn)CTCs的產(chǎn)生和發(fā)展。所以必須尋找可以特異性抑制CTCs的手段，才能阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程，減少轉(zhuǎn)移的發(fā)生概率，最終得到生存上的獲益。

免疫治療作為腫瘤治療的重要手段之一，具有常規(guī)手術(shù)或者放化療所不具有的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在腫瘤的治療實(shí)踐中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine induced killer，CIK)技術(shù)是其中較為成熟的治療手段，而其進(jìn)一步發(fā)展的D-CIK技術(shù)是指與樹(shù)突細(xì)胞(Dendritic cell，DC)共培養(yǎng)的CIK細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，DC和CIK共同培養(yǎng)后兩種細(xì)胞的數(shù)量和活性都有明顯增高，同時(shí)IL-12分泌水平也有同步的增高[13]。不但對(duì)普通腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用，并且對(duì)于那些常規(guī)化療藥物耐藥的腫瘤細(xì)胞，也具有肯定的殺傷作用[14]。多個(gè)臨床研究已經(jīng)證實(shí)，D-CIK細(xì)胞技術(shù)可以改善腫瘤患者的PFS和OS，并且不良反應(yīng)輕微[15-17]。但是其具體作用機(jī)制尚不完全明確，尤其是臨床證據(jù)尚不充分。所以我們根據(jù)既往研究成果推測(cè)，D-CIK技術(shù)改善腫瘤預(yù)后的原因可能是對(duì)針對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷與抑制，從而減少腫瘤細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)移擴(kuò)散的機(jī)會(huì)，最終獲得臨床生存的收益。

本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者接受D-CIK治療后，其循環(huán)血中腫瘤細(xì)胞數(shù)目與治療前相比較明顯減少，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。據(jù)此我們推測(cè)，D-CIK治療可能通過(guò)抑制CTCs來(lái)減少腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移機(jī)會(huì)，但其具體機(jī)制值得進(jìn)一步研究。本次研究結(jié)果對(duì)于深入理解生物免疫療法在乳腺癌治療中的作用與地位具有積極的意義。

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Inhibition of D-CIK on circulating tumor cells in advanced breast cancer.

MA Lei1,WU Si-pei2,DENG Xu-bin1, JIN Chuan1,LU Qin1,LIU Xiao-yan1,CHEN Wen-sheng1,ZOU Qing-feng1.1.The Third District of Internal Medicine Department,Affiliated Cancer Hospital of Guangzhou Medical University/Cancer Center of Guangzhou Medical University (CCGMU),Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA;2.Institute of Lung Cancer Research,Guangdong Provincial People's Hospital,Guangzhou 510095,Guangdong,CHINA.

ObjectiveTo investigate the effect of D-CIK on circulating tumor cells(CTCs)in patients with advanced breast cancer.MethodsThirty-two cases of advanced breast cancer were included.The number of tumor cells in peripheral blood circulating was detected before and after D-CIK therapy by Cellsearch system.Related adverse reactions were also observed during the treatment.ResultsAfter treatment,the number of tumor cells in peripheral blood circulating decreased from 5～18/7.5 ml(before treatment)to 2～11/7.5 ml with a statistical difference (P＜0.05).No severe side effect was observed during treatment.ConclusionD-CIK treatment could inhibit the CTCs in breast cancer.

D-CIK;Breast cancer;Circulating tumor cells

R737.9

A

1003—6350（2014）13—1884—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.13.0732

2014-04-08)

廣東省科技廳科研項(xiàng)目（編號(hào)：2011B080701021）；廣州醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目（編號(hào)：2013C61）

馬磊。E-mail：ml18882@163.com