謝寒冰， 周明瑩， 趙海峰， 王毅剛， 蔣萬楓， 趙 珊

(1.青島市“菜籃子”商品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心，山東青島266071;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071)

豆芽是深受我國居民喜愛的一類食品，但近年來問題豆芽屢有報道，一些小作坊在生產(chǎn)過程中濫用添加劑，影響其質(zhì)量安全。6-芐基腺嘌呤(6-BA)、4-氯苯氧乙酸(4-CPA)、赤霉素(GA3)等 3 種外源激素是問題豆芽培育過程中較常用的“AB粉”、“無根豆芽素”等的主要成分。4-CPA屬內(nèi)吸性植物生長調(diào)節(jié)劑，能調(diào)節(jié)植物株內(nèi)激素的平衡，刺激子房膨大，補(bǔ)充植物體內(nèi)生長素不足，促進(jìn)生長［1］，作為一種添加劑在培育無根豆芽時使用［2］。GA3和6-BA在種子萌發(fā)和休眠中的調(diào)控作用已得到廣泛認(rèn)可［3］。GA3可在植物幼苗生長過程中提高發(fā)芽率。6-BA與植物內(nèi)源激素結(jié)構(gòu)性質(zhì)相似［4］，在豆芽生長過程中可以促進(jìn)芽的形成、抑制根的生長［3］。人體攝入過多6-BA會刺激皮膚黏膜，出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象［5］。國家質(zhì)檢總局159號公告明確指出6-BA、4-CPA不得作為添加劑生產(chǎn)和使用。我國尚未制定水果、蔬菜中赤霉素最高殘留限量國家標(biāo)準(zhǔn)。針對這3種化合物的檢測方法主要有高效液相色譜法［6－11］、高效液相色譜-質(zhì)譜法［5，12，13］以及串聯(lián)質(zhì)譜法［14－16］、氣相色譜法［17］、離子色譜法［18］和薄層色譜法［19］，但這些方法只能檢測3種目標(biāo)化合物中的一種或兩種。目前尚未見到國內(nèi)運(yùn)用高分辨質(zhì)譜同時檢測這3種外源激素的報道。

本文以黃豆芽和綠豆芽為樣品，采取QuECh-ERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，and safe)前處理方法，運(yùn)用溶劑分步提取、分散固相凈化等技術(shù)進(jìn)行樣品前處理，應(yīng)用液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜同時檢測3種外源激素藥物殘留，并建立了質(zhì)譜檢索篩查庫。方法具有快速高效、高靈敏度等特點，為市場豆芽質(zhì)量安全監(jiān)控提供了新的檢測技術(shù)選擇。

1 實驗部分

1.1 儀器試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:1290二元泵液相系統(tǒng)和G6530A Q-TOF高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(安捷倫公司，USA)。Sigma 3-30ks離心機(jī)(希格瑪公司，德國);N-EVAP11氮吹儀(Organomation公司，USA)。Milli-Q去離子水發(fā)生器(Millipore公司，USA)。甲酸、甲醇、乙腈(HPLC級，Honeywell Burdick＆Jackson)。赤霉素、6-芐基腺嘌呤、4-氯苯氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品(德國 Dr.Ehrenstorfer公司)。C18、N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑(博納艾杰爾公司);硅膠、硅藻土、中性氧化鋁(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司);無水硫酸鈉、乙酸、鹽酸、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取GA3、6-BA、4-CPA標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成1.0 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，轉(zhuǎn)入棕色樣品瓶中，同時配制1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，－20℃下保存。實驗時用空白豆芽樣品提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取2 g(精確至0.01 g)打碎混勻后的豆芽樣品于聚四氟乙烯離心管中。加入2 g無水硫酸鈉、0.5 g氯化鈉，充分?jǐn)嚢枞コ?加入20 mL含1%(v/v，下同)乙酸、50%乙醇、49%乙腈的溶液，振蕩混勻5 min;以9 000 r/min離心5 min，收集上清液于50 mL聚四氟乙烯離心管中。殘渣中加入10 mL鹽酸溶液(1 mol/L)和10 mL乙腈，振蕩提取5 min，以9 000 r/min離心，收集上層乙腈溶液。合并兩次提取液，在提取液中加入1.0 g硅藻土、10 mL正己烷，振蕩混勻5 min，以9 000 r/min離心5 min后棄去正己烷層。剩余溶液在50℃水浴條件下氮吹至近干，加入2.0 mL 50%甲醇水溶液，振蕩混勻，過0.22 μm濾膜后上機(jī)測定。

1.4 色譜條件

色譜儀:Agilent 1290 Infinity LC。色譜柱:ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm ×3.0 mm，1.8 μm);柱溫:30℃。進(jìn)樣體積:10 μL。流動相:0.1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)。梯度洗脫程序:0～1.0 min，80%A;1.0～8.5 min，80%A 降到50%A;8.5～8.6 min，50%A 降到1%A;8.6～13.0 min，保持1%A;13.0～13.1 min，1%A升到80%A;13.1～15.0 min，保持80%A。流速:0.4 mL/min。

1.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜儀:Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF;離子源:雙噴射離子源(Dual AJS ESI);霧化氣壓強(qiáng):275.8 kPa;干燥氣溫度325℃，流速8 L/min;鞘氣溫度350℃，流速11 L/min。負(fù)離子模式:毛細(xì)管電壓3 000 V;毛細(xì)管出口電壓(fragmentor)130 V;錐孔電壓(skimmer)65 V;八極桿電壓750 V。采集模式:targeted MS/MS。一級質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～500，采集頻率5 spectra/s;二級質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～500，采集頻率 10 spectra/s，窗口時間 0.4 min，碰撞池能量30 V;四極桿分辨率Medium m/z 4。參比離子m/z 112.985 5、301.998 1。質(zhì)譜調(diào)諧:負(fù)離子模式自動調(diào)諧;質(zhì)量范圍:低于m/z 1 700;擴(kuò)展動態(tài)范圍2 GHz。

1.6 定性定量分析

targeted MS/MS模式下，同時對3種目標(biāo)化合物進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜全掃描，通過化學(xué)工作站軟件建立3種目標(biāo)化合物一級、二級質(zhì)譜全掃描篩查庫。定性分析時，根據(jù)目標(biāo)化合物的一級、二級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素豐度匹配、特征二級離子等檢索確認(rèn)。定量分析時，以準(zhǔn)分子離子［M －H］－峰面積外標(biāo)法計算，提取質(zhì)量數(shù)寬度為15 ppm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

為得到更好的色譜分離和質(zhì)譜離子化效率，本文參考有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)方法［2，4，5，14－16］，以甲醇-水作為流動相體系。水相中分別添加0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸銨，用這兩種流動相體系和Agilent Poroshell 120 EC-C18(100 mm ×3.0 mm，2.7 μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(100 mm×3.0 mm，1.8 μm)、Agilent Eclipse XDB-C18(150 mm ×2.1 mm，3.5 μm)3種色譜柱進(jìn)行交叉實驗。結(jié)果顯示，流動相為甲醇-水(0.1%甲酸)、色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱時，液相色譜流速設(shè)置可滿足質(zhì)譜檢測要求，質(zhì)譜離子化效率較高，3種目標(biāo)物的色譜分離對稱、峰形尖銳。圖1為在以上優(yōu)化條件下3種目標(biāo)化合物的準(zhǔn)分子離子［M －H］－提取色譜圖。

2.2 質(zhì)譜條件

2.2.1 檢測模式與定量離子

圖1 3種目標(biāo)化合物的提取色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the three target compounds

運(yùn)用Agilent G6530A Q-TOF高分辨質(zhì)譜分別對3種目標(biāo)化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜正、負(fù)離子模式全掃描，結(jié)果GA3和4-CPA在負(fù)離子模式下有強(qiáng)響應(yīng)，6-BA在正、負(fù)離子模式下均有較好響應(yīng)。綜合考慮同時檢測3種目標(biāo)化合物的儀器參數(shù)設(shè)置要求、最佳信噪比等因素，采用負(fù)離子檢測模式。負(fù)離子模式檢測的基質(zhì)干擾相對正離子模式要小，高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量測定也能進(jìn)一步降低干擾，同時由于二級質(zhì)譜靈敏度要小于一級質(zhì)譜，因此本方法采用準(zhǔn)分子離子峰面積定量。

2.2.2 誘導(dǎo)解離電壓和碰撞電壓

質(zhì)譜儀的毛細(xì)管出口區(qū)域碰撞誘導(dǎo)解離電壓影響離子傳輸效率，進(jìn)而影響檢測靈敏度?？疾炝似浞謩e為70、100、130、160和200 V 時3種目標(biāo)化合物的響應(yīng)值(見圖2)。GA3和6-BA的峰面積隨電壓升高而逐漸增大;4-CPA的峰面積在130 V前隨電壓升高而增大，在超過130 V后隨電壓升高而減小。為保證各目標(biāo)物均能得到較強(qiáng)響應(yīng)，確定毛細(xì)管出口區(qū)域碰撞誘導(dǎo)解離電壓為130 V。

圖2 不同碰撞誘導(dǎo)解離電壓條件下目標(biāo)物的質(zhì)譜響應(yīng)值Fig.2 R esponses of the target compounds under different fragmentor conditions

另外，碰撞池電壓決定母離子碎裂程度［20］，影響二級質(zhì)譜響應(yīng)值和特征峰匹配?？疾炝烁髂繕?biāo)物分別在10、20、30和40 V碰撞電壓條件下的二級質(zhì)譜。當(dāng)碰撞池電壓為30 V時，各目標(biāo)物均能得到較好的二級質(zhì)譜特征信息(見圖3)，因此選擇30 V為本方法中碰撞池電壓。

圖3 碰撞池電壓為30 V時3種目標(biāo)化合物的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of the three target compounds(collision energy:30 V)

2.2.3 二級質(zhì)譜

targeted MS/MS模式可一次進(jìn)樣同時檢測3種目標(biāo)化合物的一級和二級質(zhì)譜全掃描信息。在化學(xué)工作站設(shè)置3種目標(biāo)化合物二級質(zhì)譜檢測的母離子及保留時間等信息，同時設(shè)置時間窗口、碰撞能量和參比溶液等信息，檢測得到的二級質(zhì)譜特征離子如表1所示。

2.3 提取凈化

3種目標(biāo)物具有不同的化學(xué)性質(zhì):6-BA難溶于水，可溶于酸、堿，在酸性、堿性條件下均穩(wěn)定;4-氯苯氧乙酸在樣品中多以4-氯苯氧乙酸鈉形式存在，4-氯苯氧乙酸鈉易溶于水、堿性水溶液，酸化后生成4-氯苯氧乙酸，易溶于乙醚、乙醇等有機(jī)溶劑;GA3難溶于水，能溶于醇、酮、酯類等有機(jī)溶劑。

據(jù)此，本方法采用QuEChERS前處理技術(shù)，對比3種不同方式的回收效果:酸化乙腈(含1%乙酸)一次性提取、酸化乙醇-乙腈(1%乙酸+50%乙醇+49%乙腈)一次性提取、酸化乙醇-乙腈(1%乙酸+50%乙醇+49%乙腈)提取后再在酸化條件下以乙腈鹽析二次提取。結(jié)果酸化乙醇-乙腈溶液效果較好，但對4-CPA的回收效率不高，主要原因是仍有4-CPA以鈉鹽形式存在于試樣殘渣中，沒有被有機(jī)溶劑提出。在以酸化乙醇-乙腈提取后的殘渣中加入稀鹽酸溶液和乙腈，利用鹽析分層在酸性條件下以乙腈溶劑提取4-CPA，結(jié)果4-CPA回收效率得到有效改善。在以酸化乙醇-乙腈溶液提取目標(biāo)物時，必須加入無水硫酸鈉、氯化鈉除去試樣中的水分，因為水的存在會嚴(yán)重影響各目標(biāo)物的回收效率，且無水硫酸鈉、氯化鈉也是下一步乙腈鹽析分層提取的必要試劑。另外測試了乙醇-乙腈提取液中乙醇體積分?jǐn)?shù)變化對回收效果的影響。當(dāng)乙醇含量增加時會增多基質(zhì)干擾物的提取，但其含量過低則不利于GA3的提取，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%時能滿足回收效果和基質(zhì)凈化需求。在50 μg/kg添加水平下，各目標(biāo)物在3種不同提取條件時的添加回收率如圖4所示，分兩步提取時各化合物的添加回收效果最優(yōu)。

圖4 不同提取液對豆芽中目標(biāo)物的提取效果Fig.4 Effect of different extraction solutions on the target compounds in been sproutsExtraction solutions:1.1%acetic acid+99%acetonitrile;2.1%acetic acid+50%ethanol+49%acetonitrile;3.step one:1%acetic acid+50%ethanol+49%acetonitrile and step two:diluent hydrochloric acid+acetonitrile.

考察了C18、PSA、硅藻土、硅膠、氧化鋁5種分散劑的凈化效果。C18、PSA、硅膠、氧化鋁等4種分散劑分別不同程度地存在吸附目標(biāo)物或基質(zhì)干擾物去除效果不好等問題;而硅藻土沒有吸附目標(biāo)化合物現(xiàn)象，對樣品色素等基質(zhì)干擾物的凈化效果也優(yōu)于其他試劑。硅藻土用量為0.2～1.5 g時，均未發(fā)生目標(biāo)化合物吸附現(xiàn)象。從實際凈化效果看，硅藻土吸附劑可凈化樣品提取液中的部分色素類物質(zhì)，當(dāng)其用量高于1.0 g后，增加分散劑用量對基質(zhì)凈化效果無明顯改善。因此確定硅藻土用量為1.0 g。

表1 3種目標(biāo)物的保留時間和質(zhì)譜信息Table 1 R etention times and MS information of the three target compounds

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)物質(zhì)在色譜分離過程中與目標(biāo)化合物共流出，可能影響目標(biāo)化合物的離子化過程，進(jìn)而影響定量、線性、精密度等［21］。豆芽樣品經(jīng)過前處理過程后，提取液在提取目標(biāo)化合物的同時也會提出豆芽內(nèi)源基質(zhì)物質(zhì)和前處理過程中引入的外源基質(zhì)物質(zhì)。本方法考察了豆芽基質(zhì)對3種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜影響，用空白豆芽提取液配制10 μg/kg的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)液，用甲醇-水(5∶5，v/v)溶液配制同等濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算兩者質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度的比值。結(jié)果顯示 6-BA、Ga3、4-CPA的比值分別為 0.97、1.08、0.68。雖然固相分散劑的使用在一定程度上降低了基質(zhì)抑制，但仍不能徹底解決。為此，本方法采用基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行校正補(bǔ)償［22］，以進(jìn)一步降低基質(zhì)抑制對檢測結(jié)果的干擾。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系

取3種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，以空白基質(zhì)溶液配制成6種質(zhì)量濃度的系列梯度(1～200 μg/L)，按照1.4節(jié)和1.5節(jié)條件檢測。以準(zhǔn)分子離子峰［MH］－的色譜峰面積(y)作為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)質(zhì)量濃度(x，μg/L)作為橫坐標(biāo)，計算得到各目標(biāo)物的線性方程，其相關(guān)系數(shù)以及線性范圍等如表2所示。

表2 3種目標(biāo)物的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r)Table 2 Linear ranges，regression equations and correlation coefficients(r)of the three target compounds

2.5.2 回收率、穩(wěn)定性和定量限

以黃豆芽和綠豆芽為檢測試樣，按照本方法進(jìn)行3個水平的添加回收試驗，以6次平行測定結(jié)果計算回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等，并按信噪比(S/N)為10確定定量限，結(jié)果見表3。3種目標(biāo)化合物的回收率為79.1%～96.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.7%～10.4%。GA3和 6-BA的定量限(LOQ)為 5.0 μg/kg，4-CPA 的 LOQ 為10.0 μg/kg。

表3 3種目標(biāo)化合物的回收率、定量限和精密度(n=6)Table 3 R ecoveries，limits of quantification(LOQs)and relative standard deviations(R SDs)of the three target compounds(n=6)

2.6 方法的應(yīng)用

應(yīng)用本方法對從市場抽取的15批次黃豆芽、綠豆芽樣品進(jìn)行檢測，檢出1批次綠豆芽中6-BA含量為0.24 mg/kg，1批次黃豆芽中 GA3含量為0.19 mg/kg，1批次黃豆芽中4-CPA含量為0.49 mg/kg。分別應(yīng)用 DB33/T 625.3-2007和 SN/T 0 350-2012方法對檢出6-BA、GA3的兩份樣品進(jìn)行測定，測得 6-BA、GA3含量分別為 0.28 mg/kg、0.16 mg/kg，與本方法結(jié)果一致。用不含3種目標(biāo)化合物的黃豆、綠豆培育10批豆芽樣品，應(yīng)用本方法對其進(jìn)行檢測分析，均未檢測出3種目標(biāo)化合物。結(jié)果證明本方法的有效性。

3 結(jié)論

本文建立了應(yīng)用QuEChERS快速前處理技術(shù)和液相色譜-飛行時間質(zhì)譜檢測豆芽中3種外源植物激素的方法，具有快速高效、定性準(zhǔn)確、靈敏度高等特點，能夠滿足國內(nèi)外關(guān)于豆芽中非法添加物殘留限量的要求。本方法前處理技術(shù)在目標(biāo)物提取效率、基質(zhì)凈化效果、方法穩(wěn)定性等方面具有一定優(yōu)勢;采用的高分辨質(zhì)譜檢測技術(shù)可進(jìn)行一級、二級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)全掃描，在目標(biāo)化合物定性確認(rèn)方面具有顯著優(yōu)勢;在定量方面，本方法具有較好的穩(wěn)定性，定量限能夠滿足實際工作需要，為市場豆芽質(zhì)量安全篩查提供了新的檢測方法選擇。

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