王 雅, 王俊蘇, 向 露, 郗存顯, 陳冬東,彭 濤, 王國(guó)民, 母昭德*
(1.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,重慶400016;2.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局,重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心,重慶400020;3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京100123)
2014年2月,有外媒報(bào)道稱賽百味、麥當(dāng)勞、星巴克、漢堡王等使用添加了偶氮甲酰胺(azodicarbonamide,ADA)的面粉來制作面包,該成分通常作為橡膠鞋底和瑜伽墊的原料,這一消息引發(fā)了消費(fèi)者對(duì)面粉類食品安全的擔(dān)心。ADA作為食品添加劑在面粉中廣泛使用,具有氧化與漂白雙重作用,其主要目的是用來增加面筋,改善面團(tuán)流變學(xué)特性和機(jī)械加工性能[1]。由于ADA的降解產(chǎn)物氨基脲(semicarbazide,SEM)具有較強(qiáng)的致突變和致癌作用[2],我國(guó) GB2760-2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定小麥粉中ADA的最大使用量為45 mg/kg[3]。近年來,有大量研究表明ADA在面制品的加工過程中會(huì)全部降解,生成聯(lián)二脲(biurea,HDC)與SEM 殘留于面制品中[4-7]。由于在面制品中檢測(cè)不到ADA的存在,因此有必要建立面粉及制品中ADA的特征降解產(chǎn)物HDC的檢測(cè)方法,從而有效地監(jiān)控面粉中ADA的使用。
目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于HDC的分析方法主要有紅外光譜法[8]、核磁共振法[8]、高效液相色譜法(HPLC)[9]和 液 相 色 譜-串 聯(lián) 質(zhì) 譜 法 (LC-MS/MS)[10,11]。紅外光譜和核磁共振分析只適合于對(duì)工業(yè)上生產(chǎn)的HDC進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。與LC-MS/MS比較,HPLC的定性分析能力較差,無法對(duì)HDC進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析,容易出現(xiàn)假陽性,而且靈敏度較低。Mulder等[10]利用LC-MS/MS建立了面粉處理的肉制品中HDC的測(cè)定方法,袁麗紅等[11]建立了面粉中HDC的LC-MS/MS測(cè)定方法,而對(duì)于面粉制品中HDC的研究報(bào)告卻很少。由于HDC在串聯(lián)質(zhì)譜中響應(yīng)較低,直接測(cè)定HDC有難度,因此本研究建立了HDC的衍生化法,對(duì)面粉及多種制品中的HDC進(jìn)行了測(cè)定及確證:采用高錳酸鉀將HDC氧化生成ADA,利用對(duì)甲苯亞磺酸鈉對(duì)ADA進(jìn)行衍生化,生成對(duì)甲苯磺酰氨基脲,最后采用LCMS/MS進(jìn)行測(cè)定和確證。衍生化原理如圖1所示[12,13]。該方法新穎、靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確且測(cè)定范圍寬,適用于面粉及多種面粉制品,可以為面粉及其制品中HDC的分析提供技術(shù)支持。
圖1 HDC的衍生化反應(yīng)原理Fig.1 Principle of HDC derivatization
API4000高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB-sciex公司);SR-2DW 型強(qiáng)力振蕩器(北京安捷來科學(xué)儀器設(shè)備有限公司);3-30K型離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);XH-B型旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司);Sartorius BS224S型天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司);AS 10200B型超聲水浴儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。
聯(lián)二脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.5%,美國(guó)Chem Service);13C2,15N2-聯(lián)二脲(加拿大 Toronto Research Chemicals);鄰硝基苯甲醛(純度為98%,美國(guó)Sigma公司);水為超純水;亞鐵氰化鉀(成都市科龍化工試劑廠);乙酸鋅(上海強(qiáng)順化工試劑有限公司);高錳酸鉀(重慶川東化工有限公司);乙腈和二甲基亞砜(HPLC級(jí),美國(guó)Tedia公司);冰醋酸(HPLC級(jí),美國(guó)Fluka公司);甲酸(純度>99%,美國(guó)ROE公司);對(duì)甲苯亞磺酸鈉(純度>95%,美國(guó)Sigma公司),乙酸銨(純度>99%,美國(guó)Sigma公司)。面粉、饅頭、面包、方便面、油條均為市售。
1.2.1 溶液的配制
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:分別精密稱取適量HDC標(biāo)準(zhǔn)品(精確至0.01 mg),用水配制成質(zhì)量濃度為 20 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;置于室溫保存?zhèn)溆?,有效?0 d;根據(jù)需要,用水稀釋成相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。內(nèi)標(biāo)工作液:分別精密稱取適量HDC內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(精確至0.01 mg),用水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液;置于室溫保存?zhèn)溆?,有效?0 d。0.25 mol/L亞鐵氰化鉀溶液:稱取106.0 g亞鐵氰化鉀,用水溶解并稀釋至1 L;室溫保存,有效期90 d。1.00 mol/L乙酸鋅溶液:稱取220.0 g乙酸鋅,加30 mL冰醋酸溶解,用水稀釋至1 L;室溫保存,有效期90 d。0.06 mol/L高錳酸鉀溶液:稱取高錳酸鉀1 g,用水溶解并稀釋至100 mL;室溫保存,有效期90 d。2.5 mmol/L對(duì)甲苯亞磺酸鈉溶液:稱取0.043 5 g對(duì)甲苯亞磺酸鈉,加入50%乙腈水溶液溶解并稀釋至100 mL;室溫保存,有效期30 d。2.0 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸):稱取0.154 2 g乙酸銨溶解于900 mL的水中,加入2 mL甲酸,用水定容至1 L,超聲脫氣。
1.2.2 色譜條件
色譜柱:Shimpak XR-ODSⅡ色譜柱(150 mm×2.0 mm,2.2 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:10 μL。流動(dòng)相:A為乙腈,B為2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%(v/v)甲酸),流速0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0~2 min,5%A;2~4 min,5%A~90%A;4~7 min,90%A;7~7.5 min,90%A ~5%A;7.5~10 min,5%A。
1.2.3 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源(ESI);離子化模式:正離子模式;掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;電噴霧電壓(IS):5 500 V;霧化氣壓力(GS1):551.6 kPa;氣簾氣壓力(CUR):241.3 kPa;輔助氣壓力(GS2):344.7 kPa;離子源溫度(TEM):650℃;碰撞室入口電壓(EP):10 V;碰撞室出口電壓(CXP):12 V;監(jiān)測(cè)離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表1。
表1 待測(cè)物的離子對(duì)、駐留時(shí)間、去簇電壓和碰撞電壓Table 1 Ion pairs,dwell times,declustering potentials and collision voltages of the analytes
1.2.4 樣品預(yù)處理
準(zhǔn)確稱取2.0 g試樣于50 mL離心管中,分別加入0.2 mL HDC內(nèi)標(biāo)溶液和10 mL水,旋渦振蕩1 min后,置于振蕩器中振蕩15 min,于8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,移取上清液于25 mL比色管中;殘留物再用10 mL水提取1次;合并提取液,分別加入2 mL乙酸鋅溶液與亞鐵氰化鉀溶液,加水定容至刻度,振蕩混勻;溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,再加入5 mL正己烷脫脂,于8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min;準(zhǔn)確移取5 mL下層清液于另一離心管中,加入0.06 mol/L高錳酸鉀溶液200 μL,振蕩反應(yīng)30 min后,加入50 μL二甲基亞砜,振蕩3 min后,加入2.5 mmol/L對(duì)甲苯亞磺酸鈉溶液5 mL,振蕩衍生10 min,離心,過0.22 μm 有機(jī)濾膜后供LC-MS/MS測(cè)定。
將待測(cè)化合物(對(duì)甲苯磺酰氨基脲)溶液以流動(dòng)注射的方式注入電噴霧離子源,分別以正離子和負(fù)離子模式進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)在正離子模式下分子離子[M+H]+m/z 230.0響應(yīng)值較高,因此采用正離子掃描方式。在ESI+模式下對(duì)分子離子的子離子進(jìn)行掃描,選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩個(gè)子離子m/z 157.0和m/z 97.3為監(jiān)測(cè)離子,其中豐度最高的子離子m/z 157.0作為定量離子。再對(duì)碰撞能量、霧化氣壓力、電噴霧電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,從而確定各子離子的最佳檢測(cè)條件。對(duì)甲苯磺酰氨基脲及內(nèi)標(biāo)物母離子的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖2,定量離子提取離子色譜圖見圖3。
液相色譜分離時(shí)在流動(dòng)相中加入適量甲酸和揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨可使離子預(yù)先形成,提高待測(cè)物在ESI+模式下的電離效率,從而提高檢測(cè)的靈敏度。同時(shí)結(jié)合緩沖鹽可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值、保證良好的峰形和保持離子強(qiáng)度的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-0.2%甲酸溶液(分別含1.0、2.0、5.0和8.0 mmol/L乙酸銨)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明,采用乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%(v/v)甲酸)為流動(dòng)相時(shí),在1.2.2節(jié)的梯度洗脫條件下,目標(biāo)物的峰形好且響應(yīng)強(qiáng)度較大,分離度和靈敏度較高,因此選擇乙腈-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)作為流動(dòng)相。
圖2 (a)對(duì)甲苯磺酰氨基脲與(b)13C,15N-對(duì)甲苯磺酰氨基脲的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS/MS spectra of(a)p-toluenesulfonyl semicarbazide and(b)13C,15N-p-toluenesulfonyl semicarbazide
圖3 (a)對(duì)甲苯磺酰氨基脲及(b)13C,15N-對(duì)甲苯磺酰氨基脲的定量離子流色譜圖Fig.3 Quantitative ion current chromatograms of(a)ptoluenesulfonyl semicarbazide and(b)13C,15N-ptoluenesulfonyl semicarbazide
2.2.1 提取溶劑的選擇
HDC不溶于大部分有機(jī)溶劑,微溶于水、丙酮和 N,N-二 甲 基 甲 酰 胺 (dimethyl formamide,DMF)。Mulder等[10]采用 DMF-水(9∶1,v/v)溶液提取禽肉和海產(chǎn)品中的HDC,袁麗紅等[11]則采用純水提取面粉中的HDC。分別稱取不含HDC的空白基質(zhì)(面粉、饅頭、面包、油條、方便面)2.0 g,分別添加10 mg/kg的HDC標(biāo)準(zhǔn)品,考察水、丙酮、DMF、丙酮-水(3∶7,v/v)、丙酮-水(1∶1,v/v)、丙酮-水(8∶2,v/v)、DMF-水(7∶3,v/v)、DMF-水(1∶1,v/v)、DMF-水(3∶7,v/v)、DMF-水(5∶95,v/v)、DMF-丙酮-水(1∶1∶2,v/v/v)的提取能力。結(jié)果(見表2)表明,采用純水提取時(shí),測(cè)得的HDC的含量較高。因此,本研究采用純水作為提取溶劑。
2.2.2 提取方式與時(shí)間的優(yōu)化
本研究分別考察了振蕩提取、超聲提取與渦旋振蕩3種提取方式對(duì)試樣的提取效果,發(fā)現(xiàn)振蕩提取法的提取效果較好。另外比較了10 mL水提取多次的提取效果。結(jié)果表明,10 mL水提取2次后,增加提取次數(shù),回收率增加較小,因此將提取次數(shù)定為2次。
2.2.3 衍生化條件的選擇和優(yōu)化
采用LC-MS/MS測(cè)定時(shí),HDC在串聯(lián)質(zhì)譜中的響應(yīng)較低。為了提高其檢測(cè)靈敏度,需要對(duì)其進(jìn)行衍生化。HDC與SEM的結(jié)構(gòu)相似,而SEM的測(cè)定選用鄰硝基苯甲醛作為衍生化試劑[14],本研究考察了鄰硝基苯甲醛對(duì)HDC的衍生化效果。結(jié)果表明,采用鄰硝基苯甲醛衍生時(shí)無法得到相應(yīng)的衍生化產(chǎn)物。Hunter[13]采用對(duì)甲苯亞磺酸鈉與ADA在常溫下進(jìn)行反應(yīng)合成對(duì)甲苯磺酰胺基脲,表明對(duì)甲苯亞磺酸鈉與ADA的反應(yīng)是非常容易進(jìn)行的。由于HDC與ADA的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,本研究首先采用對(duì)甲苯亞磺酸鈉對(duì)HDC進(jìn)行衍生化,但仍然無法檢測(cè)到相應(yīng)的衍生化產(chǎn)物。目前工業(yè)生產(chǎn)ADA發(fā)泡劑大多是采用化學(xué)氧化劑使HDC氧化為ADA發(fā)泡劑,按所用氧化劑的不同又分為鉻酸鹽法、氯酸鹽法、氯氣法、過氧化氫法等。但這些方法由于成本高、操作繁瑣、生產(chǎn)工藝不易控制等缺點(diǎn)不適合于實(shí)驗(yàn)室合成ADA。Bechtold等[12]報(bào)道采用高錳酸鉀可將HDC氧化為ADA,本研究對(duì)該方法進(jìn)行了一定的改進(jìn),采用高錳酸鉀對(duì)HDC進(jìn)行氧化,方法簡(jiǎn)單快速,而且可以在常溫下進(jìn)行。因此,確定的衍生化方法為:先采用高錳酸鉀將HDC氧化成為ADA,再采用對(duì)甲苯亞磺酸鈉對(duì)ADA進(jìn)行衍生化。
表2 不同溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取能力(n=2)Table 2 Extractability of different extraction solvents for the analytes(n=2)
本研究以0.06 mol/L高錳酸鉀溶液作為氧化劑。首先考察了高錳酸鉀溶液用量(80、100、150、200、220、250 μL)的影響。結(jié)果表明隨著高錳酸鉀的用量增加,目標(biāo)物的峰面積逐漸增大,超過200 μL之后,峰面積變化不大,說明ADA與高錳酸鉀已經(jīng)反應(yīng)完全。同時(shí)考察了氧化時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)的影響。當(dāng)氧化時(shí)間為30 min時(shí),目標(biāo)物的峰面積達(dá)到最大,超過30 min,峰面積趨于平衡。因此將氧化條件定為0.06 mol/L高錳酸鉀溶液用量為200 μL,氧化時(shí)間為30 min。待氧化反應(yīng)完成后,加入50 μL的二甲基亞砜去除多余的高錳酸鉀。
對(duì)甲苯亞磺酸鈉衍生化的時(shí)間與衍生試劑的用量會(huì)影響衍生化的效果。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ADA與對(duì)甲苯亞磺酸鈉的反應(yīng)比較迅速,8 min反應(yīng)基本完成,10 min以后目標(biāo)物峰面積基本保持不變,所以本研究確定衍生反應(yīng)時(shí)間為10 min。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HDC與對(duì)甲苯亞磺酸鈉的物質(zhì)的量比在1∶25~1∶30范圍內(nèi)時(shí)衍生產(chǎn)物峰面積穩(wěn)定。對(duì)甲苯亞磺酸鈉過少可能會(huì)使ADA不能快速完全反應(yīng),衍生試劑用量過大會(huì)造成資源的浪費(fèi)而且污染環(huán)境,綜合各種因素選擇HDC與對(duì)甲苯亞磺酸鈉的物質(zhì)的量比為1∶25,即添加5 mL質(zhì)量濃度為2.5 mmol/L對(duì)甲苯亞磺酸鈉溶液進(jìn)行衍生反應(yīng)。
采用LC-MS/MS法測(cè)定時(shí),普遍存在基質(zhì)效應(yīng),即目標(biāo)化合物的質(zhì)譜響應(yīng)值會(huì)受到基質(zhì)中雜質(zhì)的影響。本研究采用提取后添加法來評(píng)價(jià)面粉、饅頭、面包、油條、方便面5種基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)的影響,通過比較基質(zhì)匹配曲線和標(biāo)準(zhǔn)品衍生物校正曲線的斜率來考察方法的基質(zhì)效應(yīng)(ME),如式(1)所示。當(dāng)ME<0時(shí),表示目標(biāo)化合物的MS/MS響應(yīng)受到抑制;相反,ME>0表示基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);當(dāng)ME的絕對(duì)值為0~20%表示較弱的基質(zhì)效應(yīng),20%~50%表示中等的基質(zhì)效應(yīng),大于50%表示較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)[15]。
計(jì)算得到5種基質(zhì)的ME值在-55.8%~-47.3%之間,說明5種基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)值具有較強(qiáng)的抑制效應(yīng)。當(dāng)采用外標(biāo)法進(jìn)行定量時(shí),HDC的回收率只有48%~71%。為了克服基質(zhì)效應(yīng),往往采用基質(zhì)匹配溶液的外標(biāo)法和同位素內(nèi)標(biāo)法等方法進(jìn)行定量[16]。但不同樣品的性質(zhì)差異很大、基質(zhì)匹配溶液制備工作繁瑣等因素限制了基質(zhì)匹配溶液的外標(biāo)法的應(yīng)用。同位素內(nèi)標(biāo)與待測(cè)物處于同一條件下,受干擾組分的影響幾乎一致,可校正目標(biāo)化合物的響應(yīng)值,提高方法的精密度和準(zhǔn)確度,操作簡(jiǎn)單;同時(shí)同位素內(nèi)標(biāo)具有與待測(cè)物最為接近的物理化學(xué)性質(zhì)、色譜行為以及響應(yīng)特征等,在前處理前加入同位素內(nèi)標(biāo)可以校正因操作過程造成的待測(cè)物的損失[17,18],因此本實(shí)驗(yàn)采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量。當(dāng)選取穩(wěn)定同位素標(biāo)記物13C2,15N2-聯(lián)二脲作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量后,回收率可達(dá)到78%~110%,可以看出內(nèi)標(biāo)法定量可以使回收率得到明顯的改善。
2.4.1 線性范圍與檢出限
移取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度為1、5、10、100、1 000、20 000 μg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,按照上述條件進(jìn)行氧化、衍生與LC-MS/MS分析。以HDC與內(nèi)標(biāo)的濃度比為橫坐標(biāo)(x),衍生產(chǎn)物對(duì)甲苯磺酰氨基脲的峰面積與13C,15N-對(duì)甲苯磺酰氨基脲的峰面積比值為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明,HDC在1~20 000 μg/L范圍具有良好的線性,線性方程為y=1.219 6x+0.030 9,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 9。
2.4.2 定量限
分別稱取不含HDC的空白基質(zhì)(面粉、饅頭、面包、油條、方便面)2.0 g,分別添加 5 μg/kg的HDC標(biāo)準(zhǔn)品,按照1.2節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)與分析,每個(gè)樣品做6個(gè)平行,計(jì)算信噪比(S/N)與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSDs)。結(jié)果表明,HDC的S/N均大于10,且回收率大于70.8%,RSDs小于5.73%。因此將HDC的定量限定為 5 μg/kg。與 Mulder等[10]建立的LC-MS/MS的定量限10 μg/kg進(jìn)行比較,本研究的定量限低,這表明本方法的靈敏度更高。
2.4.3 回收率和精密度
選取經(jīng)測(cè)定不含有HDC的面粉、饅頭、面包、油條、方便面5種基質(zhì),分別按照5.0、10.0、50.0 μg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn),每個(gè)添加水平做6個(gè)平行樣品,計(jì)算平均回收率與精密度,HDC的平均回收率在78.3%~108.0%之間,RSD范圍為0.91% ~5.73%(見表3)。與袁麗紅等[11]建立的以面粉作為基質(zhì)的LC-MS/MS方法進(jìn)行比較,本方法適合于多種面制品基質(zhì),實(shí)用性更強(qiáng),更能滿足日常檢測(cè)的需要。
表3 不同面粉制品中HDC的平均回收率和精密度(n=6)Table 3 R esults of recovery test and precision for HDC in fortified flour-based foods(n=6)
ADA加入面粉后,在面團(tuán)的發(fā)酵醒面過程中,開始降解,再經(jīng)過蒸、炸、煮、烤等加工后,ADA基本上已經(jīng)降解完全,所以在面制品中基本上沒有ADA的存在。應(yīng)用本方法對(duì)市售的饅頭、面包等54種面制品中的HDC進(jìn)行測(cè)定,用以監(jiān)測(cè)面粉中是否添加了ADA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),54個(gè)面制品中共有33個(gè)樣品檢出HDC,檢出率為61.1%,濃度范圍為10.5~29 600 μg/kg,說明這些面粉原料中添加了 ADA。某陽性樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)譜圖見圖4。
圖4 某陽性面包樣品的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)圖Fig.4 MR M chromatogram of a bread sample
本文建立了面粉及其制品中HDC的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法,采用純水振蕩提取HDC,再使用衍生化法將HDC衍生為對(duì)甲苯磺酰氨基脲,通過測(cè)定對(duì)甲苯磺酰氨基脲來測(cè)定HDC的含量,解決了HDC在液相色譜-質(zhì)譜中響應(yīng)低的難題。該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng),檢測(cè)范圍寬,能滿足分析的要求,可作為常規(guī)方法對(duì)面制品中的HDC進(jìn)行日常批量分析檢測(cè),對(duì)面粉中ADA的監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。
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