涂鴻盛， 范 軍*， 譚 藝， 林 純， 華江穎， 章偉光，*

(1.華南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，廣東廣州510663)

手性固定相-高效液相色譜(HPLC)直接拆分對(duì)映異構(gòu)體技術(shù)是當(dāng)今手性樣品分離和分析的重要手段之一［1，2］。理想的手性固定相應(yīng)具有較好的手性識(shí)別能力和較高的對(duì)映體選擇性，能適用于多種結(jié)構(gòu)類(lèi)型的對(duì)映體分離［3］。其中，基于纖維素-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)和直鏈淀粉-三(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)等的涂覆型手性固定相(如Chiralcel OD和Chiralpak AD)已成功用于多種手性化合物的拆分［4，5］。但涂覆型手性固定相不耐高壓，且溶劑耐受性差，在一些非常規(guī)流動(dòng)相溶劑(如四氫呋喃、氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯等)中，涂覆在硅膠表面的多糖衍生物會(huì)溶脹，甚至溶解，手性柱的分離性能驟降［3］。為了拓展多糖衍生物手性固定相的應(yīng)用范圍，Okamoto 等［6－8］、Kimata等［9］和 Francotte［10］分別研發(fā)了鍵合型多糖手性固定相的制備。與傳統(tǒng)的涂覆型手性固定相材料相比，鍵合型手性固定相中手性選擇劑與硅膠基質(zhì)間通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合，化學(xué)穩(wěn)定性顯著提高，溶劑耐受性更好，流動(dòng)相和樣品溶劑的選擇更多。目前已有公司相繼推出了一系列鍵合型多糖手性柱產(chǎn)品，如Chiralpak IA-IF［11，12］。

與通過(guò)二異氰酸酯與硅膠鍵合的方法［6］、自由基共聚反應(yīng)法［9］和光化學(xué)合成法［10］等相比，施陶丁格(Staudinger)反應(yīng)法［13－15］具有條件溫和、過(guò)程易控制和重現(xiàn)性好的特點(diǎn)。Zhang等［16］利用該方法制備了鍵合6-疊氮-6-脫氧纖維素-苯基氨基甲酸酯的手性固定相。本課題組也曾制備了以6-疊氮-6-脫氧纖維素(或直鏈淀粉)-3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯為手性選擇劑的鍵合型多糖手性固定相［17，18］。本研究采用施陶丁格反應(yīng)將6-疊氮-6-脫氧纖維素-3，5-二氯苯基氨基甲酸酯鍵合到氨丙基硅膠上，得到了一種新的鍵合型手性固定相(命名為ImCel)，并研究了其手性分離性能，探討了非常規(guī)流動(dòng)相溶劑與糖單元上取代基對(duì)固定相分離性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津SPD-15C高效液相色譜系統(tǒng)，配有紫外檢測(cè)器、帶20 μL定量環(huán)的7725i進(jìn)樣器和N2000工作站(日本島津公司);Spectrum One紅外光譜儀、TGA7熱分析儀、2400 CHN元素分析儀(美國(guó)Perkin-Elmer公司)。

微晶纖維素(分析純，上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司);裸硅膠(5 μm，30 nm，日本Fuji Silysia化學(xué)有限公司);3，5-二氯苯異氰酸酯(濮陽(yáng)市宏大圣導(dǎo)新材料有限公司);正己烷、異丙醇、乙醇(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，三氟乙酸、二乙胺(色譜純，上海晶純生化科技股份有限公司);其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。在固定相合成實(shí)驗(yàn)中，吡啶、甲苯、四氫呋喃用標(biāo)準(zhǔn)方法脫水干燥后使用。20種手性化合物樣品結(jié)構(gòu)式如圖1所示，由廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供。

1.2 ImCel的制備

ImCel的合成路線如圖2所示。參考文獻(xiàn)［18］方法得到6-疊氮-6-脫氧纖維素(Ⅰ)。將化合物Ⅰ(1.00 g)均勻分散在90 mL無(wú)水吡啶中，加入過(guò)量的3，5-二氯苯異氰酸酯(7.00 g，為纖維素上羥基物質(zhì)的量的2倍用量)，100℃下反應(yīng)48 h。蒸除吡啶后加入甲醇，析出固體，得到6-疊氮-6-脫氧纖維素-3，5-二氯苯基氨基甲酸酯(Ⅱ)。參考文獻(xiàn)［13，14］方法制備氨丙基硅膠。在氨丙基硅膠(4.00 g)上均勻涂敷化合物Ⅱ(1.00 g)，然后超聲分散于30 mL甲苯中。逐滴加入15 mL含三苯基膦(Ph3P，2.00 g)的甲苯溶液，CO2環(huán)境下過(guò)夜反應(yīng)。過(guò)濾，依次用丙酮和四氫呋喃洗滌，最后真空干燥過(guò)夜得到目標(biāo)產(chǎn)物ImCel。

1.3 色譜柱填裝

將ImCel均勻分散于正己烷-異丙醇溶液(80∶20，v/v)中，以正己烷-異丙醇溶液(90∶10，v/v)為頂替液，在45 MPa壓力下采用勻漿法將其裝入不銹鋼柱管(150 mm×4.6 mm)中。

1.4 色譜條件和計(jì)算

液相色譜分離實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行。樣品用乙醇溶解，流動(dòng)相使用前經(jīng)過(guò)濾及超聲脫氣處理。檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，未注明時(shí)流動(dòng)相的流速為1.0 mL/min。

保留因子k=(tR－t0)/t0，其中tR為樣品在柱上的保留時(shí)間，t0為死時(shí)間。分離因子α=k2/k1，其中k1和k2分別為第1個(gè)和第2個(gè)洗脫對(duì)映異構(gòu)體的保留因子。分離度Rs=2(tR2－tR1)/(w2+w1)，其中tR1和tR2分別為第1個(gè)和第2個(gè)洗脫對(duì)映異構(gòu)體的保留時(shí)間，w1和w2分別為相應(yīng)對(duì)映異構(gòu)體色譜峰的半峰寬［13，14］。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性選擇劑及手性固定相的表征

圖1 20種手性化合物的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structures of 20 chiral compounds

圖2 ImCel的合成路線圖Fig.2 Synthetic route of the ImCel

對(duì)實(shí)驗(yàn)中制備的手性選擇劑(化合物Ⅱ)和手性固定相材料進(jìn)行紅外光譜表征。在化合物Ⅱ中，3 350 cm－1附近O－H伸縮振動(dòng)峰的強(qiáng)度變?nèi)?，? 319 cm－1處出現(xiàn) N－H的特征吸收峰，在2 112 cm－1處出現(xiàn)N3的特征吸收峰，在1 735 cm－1處出現(xiàn)C=O的特征吸收峰。在ImCel的紅外光譜中，2 100 cm－1附近的吸收峰消失，1 038 cm－1處出現(xiàn)Si－O－Si的特征吸收峰，纖維素單元上的其他特征吸收帶(C=O和N－H)仍可觀察到。

對(duì)氨丙基硅膠、化合物Ⅱ及手性固定相分別進(jìn)行了元素分析?；衔铫虻慕Y(jié)果為:C 67.34%、H 6.58%、N 1.01%;ImCel的結(jié)果為:C 7.24%、H 0.98%、N 1.05%。與氨丙基硅膠的元素分析結(jié)果(C 4.19%、H 0.81%、N 2.73%)相比，在制備得到的手性固定相中，碳含量明顯增加。另一方面，由熱重分析結(jié)果可知，從室溫到800℃范圍內(nèi)，ImCel的失重百分?jǐn)?shù)為20.54%，氨丙基硅膠在相同溫度范圍內(nèi)的失重百分?jǐn)?shù)為5.57%。這些結(jié)果都表明，在發(fā)生施陶丁格反應(yīng)后，手性選擇劑(即化合物Ⅱ)被有效結(jié)合到硅膠表面。

2.2 ImCel的分離性能

研究了ImCel對(duì)20種手性化合物的分離性能，分析結(jié)果見(jiàn)表1。其中17對(duì)手性化合物得到了基線分離(分離度Rs≥1.5)。在流動(dòng)相的選擇上，除樣品6和18外，其余15種樣品在正己烷-醇的流動(dòng)相條件下均可實(shí)現(xiàn)基線分離。此外，ImCel在反相條件下也具有較好的手性分離性能［11，19，20］，如樣品2在流速為0.7 mL/min的甲醇-醋酸/三乙胺緩沖溶液(0.1%，v/v，pH 4.8)(70∶30，v/v)條件下的Rs為1.89，α為1.36;樣品6在流速為0.7 mL/min的乙腈-醋酸/三乙胺緩沖溶液(0.1%，v/v，pH 5.4)(70∶30，v/v)條件下的 Rs為1.80，α 為1.32;樣品19在流速為0.7 mL/min的甲醇-水-三氟乙酸(75∶25∶0.1，v/v/v)條件下的 Rs為 2.22，α 為1.48。對(duì)比可知，ImCel在正相條件下的分離性能優(yōu)于其在反相條件下的分離性能，所以后續(xù)工作主要在正相條件下進(jìn)行。

多糖衍生物手性固定相對(duì)手性分子的識(shí)別關(guān)鍵在于固定相與底物分子間的相互作用(如氫鍵、偶極-偶極相互作用、π－π作用等)和多糖自身高度有序的結(jié)構(gòu)［20］。ImCel上同時(shí)有脲鍵、酯基和芳環(huán)等官能團(tuán)，極性的苯氨基甲酸酯基能夠圍繞纖維素主鏈形成螺旋溝槽［20］;而拉唑類(lèi)化合物(樣品1～5)中同樣含有O、N等原子及芳環(huán)，易與手性固定相發(fā)生相互作用，從而得到良好的拆分。拉唑類(lèi)化合物樣品的Rs均在3.0以上(見(jiàn)表1)。

表1 ImCel對(duì)20種手性化合物的HPLC拆分條件與分離結(jié)果Table 1 Conditions and the separation performances on ImCel for 20 chiral compoundsby HPLC under optimized conditions

2.3 非常規(guī)流動(dòng)相溶劑對(duì)ImCel分離性能的影響

與涂覆型手性固定相相比，鍵合型多糖手性固定相對(duì)溶劑耐受性好，適用于更多的流動(dòng)相體系［11，12，20］。在本研究中，以 Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1，v/v/v)和 Hex-IPA(80∶20，v/v)為基礎(chǔ)，以10%(v/v)的非常規(guī)流動(dòng)相溶劑(如氯仿、四氫呋喃和乙酸乙酯等)替代10%(v/v)的醇得到新的流動(dòng)相，分別考察ImCel在新流動(dòng)相條件下對(duì)樣品10～20的分離情況。結(jié)果表明，相對(duì)于丙酮、四氫呋喃、乙酸乙酯和二氯甲烷等溶劑，在流動(dòng)相中加入氯仿可明顯提高ImCel對(duì)手性樣品的分離能力。因此，本研究主要考察添加氯仿對(duì)固定相手性識(shí)別能力的影響。

如表2所示，添加非常規(guī)流動(dòng)相溶劑后，ImCel對(duì)樣品10、11、14和18的分離能力明顯增強(qiáng)。在流動(dòng)相Hex-IPA(80∶20，v/v)中，樣品10的兩種對(duì)映體同時(shí)被洗脫，無(wú)法得到拆分;添加10%THF后，樣品10在 ImCel上的保留增強(qiáng)，分離度增大到0.73(見(jiàn)圖3a)。樣品18在Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1，v/v/v)的流動(dòng)相中分離度僅為0.69，添加氯仿后，分離度增大到1.56(見(jiàn)圖3b)。此外，添加氯仿對(duì)這些樣品分離的影響不完全相同，除樣品17外，其余樣品的分離因子都增大，但分離度的變化趨勢(shì)略有不同。

表2 非常規(guī)流動(dòng)相溶劑對(duì)ImCel分離性能的影響Table 2 Effects of non-standard solvents on the separation performance of the ImCel

圖3 樣品10和18在不同流動(dòng)相中的分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of samples 10 and 18 under different mobile phase conditionsMobile phases:a.Hex-IPA(80∶20，v/v);b.Hex-IPA-THF(80∶10∶10，v/v/v);c.Hex-EtOH-TFA(80∶20∶0.1，v/v/v);d.Hex-EtOH-CHCl3-TFA(80∶10∶10∶0.1，v/v/v/v).

2.4 糖單元上取代基對(duì)固定相分離性能的影響

此前，本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了一種以6-疊氮-6-脫氧纖維素-(3，5-二甲基苯基氨基甲酸酯)為手性選擇劑的鍵合型手性固定相(命名為RC-IB)［18］。RC-IB和ImCel都以纖維素為原料，通過(guò)施陶丁格反應(yīng)將手性選擇劑鍵合到硅膠上;不同的是，RC-IB苯環(huán)上的3，5-位氫原子被甲基取代，而ImCel苯環(huán)上的3，5-位氫原子被氯原子取代。在流動(dòng)相為 Hex-EtOH-TFA(90∶10∶0.1，v/v/v)的條件下，研究這兩種固定相對(duì)一系列芴甲氧羰基(fmoc)-氨基酸衍生物(12～20)分離性能的差異，以探討纖維素糖單元上取代基團(tuán)對(duì)分離性能的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 樣品12～20在ImCel和R C-IB上的拆分結(jié)果Table 3 Chromatographic data for samples 12－20 on ImCel and R C-IB

從樣品的保留情況分析，除樣品18外，其余樣品在RC-IB上的保留因子都比在ImCel上的大，說(shuō)明樣品在RC-IB上的保留較強(qiáng)。從拆分結(jié)果分析，RC-IB對(duì)樣品12、14和18表現(xiàn)出良好的識(shí)別能力，相應(yīng)的分離度和分離因子都優(yōu)于ImCel柱，但對(duì)樣品15、17和19無(wú)分離趨勢(shì)。ImCel對(duì)這一系列fmoc-氨基酸衍生物都表現(xiàn)出良好的識(shí)別能力，其中對(duì)樣品13、15～17、19和20的拆分性能明顯優(yōu)于RC-IB。

雖然兩種手性固定相的骨架結(jié)構(gòu)、基質(zhì)材料、鍵合方式相同，衍生官能團(tuán)(即苯氨基甲酸酯)相似，與底物分子間形成的相互作用力(如氫鍵、偶極-偶極相互作用和π－π作用等)相似，但苯環(huán)上的取代基會(huì)影響芳環(huán)及相鄰官能團(tuán)的電荷密度，從而影響固定相與底物間的相互作用，進(jìn)而影響其手性拆分性能。對(duì)于RC-IB，甲基的存在使苯環(huán)的π-電子密度增大，易與顯π-酸性的底物分子產(chǎn)生π－π作用;對(duì)于ImCel，氯原子的吸電子效應(yīng)引起苯環(huán)的π-電子密度降低，對(duì)鄰近酰胺基的N－H鍵產(chǎn)生遠(yuǎn)程吸引作用，使得氫原子的電子密度降低，從而易與底物中的氫鍵給體產(chǎn)生氫鍵相互作用。這些相互作用都加強(qiáng)了固定相對(duì)手性底物的拆分性能［21］，因此，Im-Cel和RC-IB間表現(xiàn)出一定的互補(bǔ)性。

由表3和圖4可以看出，除樣品18外，其余化合物在兩種固定相上的洗脫順序恰好相反，比如樣品12和13的L型對(duì)映體在ImCel上的保留較弱，先于D型對(duì)映體被洗脫;而對(duì)于RC-IB，D型對(duì)映體則先于L型對(duì)映體被洗脫。對(duì)映體洗脫反轉(zhuǎn)是高效液相色譜手性分離中一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，盡管文獻(xiàn)報(bào)道改變手性選擇劑的種類(lèi)及固定方式［21］、柱溫［22］、流動(dòng)相的 pH 值［23，24］、有機(jī)添加劑的種類(lèi)和比例［23，24］等條件可能引起對(duì)映體洗脫反轉(zhuǎn)，但實(shí)際并不多見(jiàn)，目前對(duì)對(duì)映體洗脫反轉(zhuǎn)現(xiàn)象尚難以解釋和預(yù)測(cè)。

圖4 ImCel和R C-IB對(duì)樣品12和13的分離色譜圖Fig.4 Chromatograms of samples 12 and 13 separated on ImCel and R C-IB，respectivelyMobile phase:Hex-EtOH-TFA(90∶10∶0.1，v/v/v).

3 結(jié)論

采用施陶丁格反應(yīng)得到了一種新的鍵合型纖維素手性固定相ImCel，研究了其對(duì)20種手性化合物的拆分性能，討論了添加非常規(guī)流動(dòng)相溶劑對(duì)固定相分離性能的影響，研究了ImCel和RC-IB對(duì)一系列fmoc-氨基酸衍生物的分離性能差異，探討了引起這些差異的原因。結(jié)果表明，ImCel對(duì)所選的手性化合物表現(xiàn)出了良好的分離性能，且添加非常規(guī)流動(dòng)相溶劑可改善其對(duì)底物的識(shí)別能力。ImCel和RC-IB對(duì)一系列fmoc-氨基酸樣品的分離具有互補(bǔ)性，并發(fā)現(xiàn)了手性固定相引起的對(duì)映體洗脫反轉(zhuǎn)現(xiàn)象。

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