王振斌，王璽，林曉明，馬海樂，王林，馬曉珂，王干，白志杰

( 江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

芝麻屬胡麻科（Pedecliecease）胡麻屬（Sesamum indicum L.）植物，又名胡麻、白麻、油麻、脂麻，是世界上最古老的油料作物之一，產(chǎn)量在世界油料作物中占第七位[1-4]。芝麻餅粕是芝麻籽實取油后的副產(chǎn)物。在我國 80%以上的芝麻用來榨取芝麻油，年產(chǎn)量就在 50萬 t以上。芝麻餅粕蛋白質平均含量在40%～46%，粗脂肪含量在3.4%～10.3%，粗纖維含量在2.6%～5.6%，還含有少量的鈣、磷等礦物質[4]。芝麻餅粕蛋白質氨基酸種類齊全，并且含量豐富，特別是含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸），顯著高于其他植物，且無抗營養(yǎng)因子[5]，除賴氨酸含量略低外，其他接近或達到FAO/WHO的推薦值，是一種很好的蛋白質資源[6-7]。

分離制備植物蛋白質的方法多種多樣，例如堿溶酸沉法、酶解法、反膠束法、膜分離法等[8-18]。堿溶酸沉法是目前應用的最多而且已用于產(chǎn)業(yè)化的方法，該法操作簡便、易于控制、成本低廉。芝麻蛋白質主要是堿溶性蛋白質，約占67%，在堿性條件下溶解度較大，一般仍采用堿溶酸沉法從芝麻餅粕制取芝麻分離蛋白質[7-8]。目前研究大多以測定溶解在堿液中的氮的總量計算提取率，而蛋白質在堿液中降解為肽或氨基酸的部分難以酸沉得到，導致蛋白提取率難以準確判斷。以水代法制備芝麻油的餅粕制備蛋白的研究較少。

本文以芝麻餅粕為原料，采用堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質，并通過單因素試驗及響應曲面設計優(yōu)化出堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質的最佳工藝參數(shù)，為芝麻餅粕蛋白質進一步制備功能肽等的開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻餅粕 新沂吉順昌油脂科技有限公司，其中粗蛋白質35.99%，粗脂肪15.28%，水分8.48%，灰分9.96%，其他35.61%。

無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀等（分析純） 購于國藥集團化學試劑公司。

Fz-4藥物粉碎機 溫嶺市百樂粉碎設備廠；pH5-3C型pH計 上海理達儀器廠；HH-A恒溫水浴攪拌鍋 江蘇金壇市中大儀器廠；SPF401F電子天平 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）中國有限公司；TGL-16高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康試驗儀器有限公司；FOSS 2100型凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質的工藝 取過 80目篩的芝麻餅粕若干克，加入90mL的去離子水配成相應濃度的溶液，以1mol/L NaOH溶液調(diào)pH，在一定溫度下用磁力攪拌器攪拌一定時間。離心過濾，所得上清液即為芝麻餅粕蛋白質提取液。以1mol/L 鹽酸調(diào)上清液pH至4.0（芝麻餅粕蛋白質等電點）使蛋白質沉淀，靜止30min后4500r/min離心20min，棄上清，所得沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫浸泡30min，離心，再加兩次2倍體積去離子水洗滌，離心，下層蛋白質真空冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質產(chǎn)品。測定其蛋白質含量，并計算蛋白質提取率。

1.2.2 蛋白質提取率和蛋白質得率的計算 采用半微量凱氏定氮法測定蛋白質含量，用式（1）和式（2）計算芝麻餅粕蛋白質提取率和得率：

1.2.3 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質的單因素設計 在堿液提取芝麻餅粕蛋白質的過程中，分別研究NaOH濃度（0、0.11、0.22、0.33、0.44、0.55mol/L），液料比（5、10、15、20、25、30、35mL/g），提取溫度（30、40、50、60、70、80、90℃），提取時間（0.5、1、2、3、4、5、6h）及提取次數(shù)（1、2、3、4次）對蛋白質提取率的影響。

1.2.4 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質的響應面優(yōu)化設計 根據(jù)Box-Behnken[19-20]中心組合試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，選取NaOH濃度、提取溫度、提取時間、液料比為響應面分析試驗的因素，進行4因素3水平設計（表1）。通過Design Expert 7.0 Trial軟件對試驗結果進行回歸分析，預測最優(yōu)參數(shù)。

表1 響應面分析因素與水平表Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 芝麻餅粕蛋白質等電點的測定 將提取的芝麻餅粕蛋白質溶液，分裝到 5只離心管中，每只100mL，用HCl調(diào)至不同的pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），靜止30min后4500r/min離心20min，測定上清液中的蛋白質含量，并計算蛋白質的沉淀量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用 SPSS軟件分析，所得試驗結果用“平均值±標準誤差”表示。p<0.05 為差異顯著水平，p<0.01 為差異極顯著水平。

2 結果與分析

2.1 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質的單因素試驗

2.1.1 NaOH濃度對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響 在液料比為15，提取溫度為60℃，提取時間為4h，提取次數(shù)1次的條件下，NaOH濃度對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響如圖1（A）所示。由圖1（A）可知，在NaOH濃度0～0.33 mol/L范圍內(nèi)，芝麻餅粕蛋白質提取率隨 NaOH濃度的增大而提高，各組間差異顯著（p<0.05）。當NaOH濃度為0.33 mol/L時蛋白質提取率達到57.36%，此后隨著NaOH濃度的繼續(xù)升高蛋白質提取率未見顯著變化。芝麻蛋白質中，80%為α球蛋白質，由于經(jīng)過壓榨處理而變性，其水溶性降低，但仍可在堿性條件下適度降解而溶出。稀堿有利于蛋白質的提取，過高堿液濃度時，蛋白質提取率有所下降，并且過高堿液濃度會改變蛋白質的營養(yǎng)學特性，生成賴氨酰丙氨酸這些物質有毒，引起營養(yǎng)物質的損失[21]。高堿還會使蛋白質變性和水解，不利于被酸沉淀，影響蛋白質提取率，同時，也增強了美拉德反應，影響產(chǎn)品色澤[22]。綜合考慮，選擇NaOH濃度0.33 mol/L作進一步優(yōu)化。

2.1.2 液料比對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，提取溫度為60℃，提取時間為4 h，提取次數(shù)1次的條件下，液料比對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響如圖1（B）所示。由圖1（B）可知，隨著液料比的增大，芝麻餅粕蛋白質提取率不斷增大，當液料比為25時芝麻餅粕蛋白質提取率為 66.09%，此后隨著液料比繼續(xù)增大，蛋白質提取率增加緩慢。如果液料比過小，提取體系的黏度過大，物料擴散速度慢，不利于蛋白質的溶出，使提取不完全。增大液料比，蛋白質提取率增加，但增加的幅度不大，且過大的料液比不利于蛋白質提取后的濃縮沉淀。因此考慮到成本及后面的離心沉淀步驟，選取液料比25作進一步優(yōu)化。

2.1.3 提取溫度對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，液料比為25，提取時間為4 h，提取次數(shù)1次的條件下，提取溫度對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響如圖1（C）所示。由圖1（C）可知，在溫度30～60℃范圍內(nèi)，芝麻餅粕蛋白質提取率隨溫度的升高而提高，各組間差異顯著（p<0.05）；當溫度達到70℃時蛋白質提取率為74.05%，此后再提高溫度，蛋白質提取率增加緩慢。這是因為較高的溫度增加了蛋白質的溶解度和溶出速率?？紤]到過高的溫度可能對蛋白質結構和活性造成影響，并且溫度高，能耗大，因此選取提取溫度70℃作進一步優(yōu)化。

2.1.4 提取時間對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，液料比為25，提取溫度為70℃，提取次數(shù)1次的條件下，提取時間對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響如圖 1（D）所示。由圖 1（D）可知，在提取時間0～4 h范圍內(nèi)，芝麻餅粕蛋白質的提取率隨著提取時間的延長而增大，超過4 h后芝麻餅粕蛋白質提取率稍有下降。這可能是由于在加熱作用下分子震動加快，摩擦增加蛋白質的溶解作用，從而有利于提取。但是提取時間過長可能導致蛋白質變性?？紤]到能源和蛋白質在高溫下品質保持的問題，故選擇提取時間4 h作進一步優(yōu)化。

2.1.5 提取次數(shù)對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，液料比為25，提取溫度為70℃，提取時間為4h的條件下，提取次數(shù)對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響如圖1（E）所示。由圖1（E）可知，提取次數(shù)對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響不顯著（p>0.05)。多次提取試驗不僅耗能耗時，而且對蛋白質提取的影響很小，因此選取提取次數(shù)1次作進一步蛋白質優(yōu)化的研究。

1 各因素對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響注：A ：NaOH濃度、B：液料比、C：提取溫度、D：提取時間和E：提取次數(shù)Fig.1 Effects of the extraction conditions on the extraction rate of sesame cake protein

2.3 響應面法優(yōu)化堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質的提取工藝

根據(jù)單因素試驗結果，選取對芝麻餅粕蛋白質提取率影響顯著的4個因素（NaOH濃度、提取溫度、提取時間、液料比），利用Design-Expert 7.0 Trial軟件設計了4因素3水平的響應面分析試驗，試驗設計與結果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Tab. 2 Design and result of Box-Behnken experiment

23 0 -1 0 1 68.56 24 0 1 0 1 75.13 25 0 0 0 0 74.9 26 0 0 0 0 73.28 27 0 0 0 0 72.97

表3 方差分析Tab. 3 Analysis of variance

各因素經(jīng)二次多項回歸擬合后，得到芝麻餅粕蛋白質提取率（Y）與 NaOH濃度、提取溫度、液料比、提取時間四個因素的二次多項回歸方程如式（3）所示：

從表 4可以看出，該模型回歸極顯著，失擬項不顯著，并且該模型的R2=0.9480，R2Adj=0.8874，說明回歸方程的擬合度較好，可以較好解釋模型的變化。其中模型一次項X1、X2、X3、X4，交互項X1X4、二次項X12對試驗結果的影響是極顯著的，X22達到顯著水平，其余項均不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結果的影響排序，NaOH濃度>提取溫度>液料比>提取時間。

剔除不顯著項，簡化后的二次多項回歸方程如式（4）所示：

根據(jù)回歸方程得到因子間的響應面分析圖，如圖2所示。圖2反映了提取時間、NaOH濃度、液料比和提取溫度各因素兩兩之間的交互作用對芝麻餅粕蛋白質提取率的影響。

圖2 交互作用對芝麻餅粕蛋白質提取率影響的響應圖Fig.2 Response surface of effects on extraction rate of sesame cake protein

通過響應面回歸方程，經(jīng) Design-expert軟件分析，可以得出模型中最佳條件參數(shù)：NaOH濃度0.37 mol/L，提取溫度75.19℃，提取時間4.7 h，液料比25.19，提取次數(shù)1次，在此參數(shù)下芝麻餅粕蛋白質提取率為76.22%。按上述最佳條件進行驗證試驗，重復三次芝麻餅粕蛋白質提取率分別為77.15%、76.84%、76.56%，其平均值為76.85%，與模型理論預測值76.22%無顯著差異，表明該響應面模型是可行的。

2.3.4 芝麻餅粕蛋白質等電點的確定 選用pH 3.0～5.0對提取的芝麻餅粕蛋白質溶液進行沉淀，其沉淀率如圖3所示。由圖3可知，芝麻餅粕蛋白質的沉淀率在pH 4時最高。因此，芝麻餅粕蛋白質的最佳等電點為pH 4。

圖3 不同pH對芝麻餅粕蛋白質沉淀率的影響Fig 3 Effects of different pH on protein precipitation rate

2.3.5 堿溶酸沉法制備的芝麻餅粕蛋白質基本成分的測定 利用等電點沉淀法（pH為4.0）獲得的蛋白質經(jīng)70%乙醇脫色處理后，產(chǎn)品顏色明顯變淺，呈淺灰色，芝麻餅粕蛋白質得率為 38.11%。芝麻餅粕蛋白質產(chǎn)品成分為粗蛋白質58.76%，粗脂肪4.63，水分2.03%，灰分4.96，其他29.62。

3 結論

3.1 以脫脂后的芝麻餅粕為原料，采用堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質。在單因素試驗的基礎上，通過響應面優(yōu)化試驗確定最佳工藝條件為：NaOH濃度 0.37 mol/L，提取溫度75.19℃，提取時間4.7 h，液料比25.19，在此參數(shù)下芝麻餅粕蛋白質提取率為76.22%。

3.2 通過試驗確定芝麻餅粕蛋白質等電點為pH 4，經(jīng)沉淀、70%乙醇脫色、冷凍干燥后所得的芝麻餅粕蛋白質產(chǎn)品蛋白質含量為58.76%。

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