李 寧，陳寶娣，劉洪波，郭繼強(qiáng)

（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116034）

葉綠素是一種天然色素，是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，它是由能與多種金屬原子結(jié)合的葉琳與鎂原子結(jié)合的產(chǎn)物[1]。葉綠素作為一種天然食用色素，如葉綠素的衍生物葉綠素銅鈉鹽，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。葉綠素也可以作為醫(yī)藥產(chǎn)品上的著色劑并且有一定的醫(yī)療用途，葉綠素有極好的消炎、促進(jìn)愈合作用，還保肝護(hù)肝功能[2-4]。目前，葉綠素藥物非常之多，這些產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)為社會(huì)創(chuàng)造了很大的經(jīng)濟(jì)效益。因此對(duì)于葉綠素的研究具有極大的價(jià)值和意義。

甘蔗糖廠在制糖過(guò)程中產(chǎn)生大量的濾泥，如若長(zhǎng)期堆棄，不僅污染環(huán)境，而且會(huì)造成資源的浪費(fèi)。濾泥中有大量的葉綠素，至今還未很好利用，多數(shù)糖廠只是將其出售給農(nóng)民做肥料。若能將濾泥中的葉綠素提取出來(lái)，將大大提高糖廠的經(jīng)濟(jì)效益[5]。葉綠素存在于甘蔗糖廠濾泥中甘蔗渣細(xì)胞中。在甘蔗糖廠濾泥葉綠素提取過(guò)程中，由于甘蔗細(xì)胞壁的束縛作用，葉綠素不易溶出[6]。甘蔗細(xì)胞壁主要由纖維素和果膠組成。纖維素酶和果膠酶能將組成細(xì)胞壁的纖維素和果膠骨架降解進(jìn)而破壞細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞內(nèi)葉綠素的溶出。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)外源添加纖維素酶、果膠酶并結(jié)合溶劑萃取提取葉綠素，研究混合酶比例及用量、混合酶酶解溫度、混合酶酶解時(shí)間以及料液比對(duì)甘蔗糖廠濾泥中葉綠素提取的影響，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，旨在提高甘蔗糖廠濾泥的利用價(jià)值。為甘蔗糖廠工業(yè)化提取葉綠素提供一定的理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗糖廠濾泥：廣西合浦西場(chǎng)永鑫糖業(yè)有限公司；纖維素酶(35u/mg)：上海源葉生物科技有限公司；果膠酶(40u/mg)：solarbio公司；95%乙醇分析純：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

攪拌機(jī)：廣東美的精品電器制造有限公司；YP402N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩器：鞏義市英峪予華儀器廠；循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉綠素測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定葉綠素含量，主要是以Arnon計(jì)算法為基礎(chǔ)。葉綠素質(zhì)量濃度的Arnon 法計(jì)算公式：

Ca/(mg/L)＝12.7A663－2.69A645

Cb/(mg/L)＝22.9A645－4.68A663

C總/(mg/L)＝Ca＋Cb

式中Ca、Cb為葉綠素a、b的質(zhì)量濃度；C總為總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度；A663、A645分別為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm和645nm處的吸光度。

1.2.2 生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素的方法

稱取2g干燥且粉碎成粉末的甘蔗糖廠濾泥，置于100mL三角瓶中，按不同料液比加入95%乙醇，然后加入一定量的纖維素酶和果膠酶，在恒溫振蕩器中，一定酶解溫度和一定酶解時(shí)間下水浴振蕩。真空抽濾得到提取液，收集濾液，濾渣用同濃度提取溶劑反復(fù)洗滌幾次，濾出洗液至提取液中，記錄提取液的總體積，通過(guò)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)出663、645nm處的吸光度，根據(jù)Arnon 公式即可計(jì)算出提取液中葉綠素的總含量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

選取纖維素酶用量、果膠酶用量、混合酶比例、混合酶酶解溫度、混合酶酶解時(shí)間、料液比6個(gè)因素進(jìn)行研究，利用單因素實(shí)驗(yàn)選取各個(gè)因素的較優(yōu)水平。

1.2.3.1 纖維素酶用量 稱取粉碎后的干濾泥粉末 2g分別放入 5個(gè) 100ml三角瓶中，按料液比1∶8加入95%乙醇，固定酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為3 h，分別以加入纖維素酶的量 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g為實(shí)驗(yàn)點(diǎn),每組三個(gè)平行，考察加入纖維素酶的量對(duì)葉綠素提取的影響。

1.2.3.2 果膠酶用量 參考實(shí)驗(yàn)步驟1.2.3.1，加入果膠酶的量分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0g/100g,每組三個(gè)平行，考察加入果膠酶的量對(duì)葉綠素提取的影響。

1.2.3.3 纖維素酶和果膠酶混合比例 稱取粉碎后的干濾泥粉末 2g分別放入7個(gè)100ml三角瓶中，按料液比1∶8加入95%乙醇，固定酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為3 h，加入總酶量為1.6g/100g,分別以加入纖維素酶和果膠酶酶質(zhì)量比 4：1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1：4為實(shí)驗(yàn)點(diǎn),每組三個(gè)平行，考察纖維素酶和果膠酶混合比例對(duì)葉綠素提取的影響。

1.2.3.4 混合酶酶解溫度 稱取粉碎后的干濾泥粉末2g分別放入6個(gè)100ml三角瓶中，按料液比1∶8加入95%乙醇，固定酶解時(shí)間為3 h，纖維素酶和果膠酶混合比例為2：1，混合酶總量為1.6g/100g,分別以混合酶酶解溫度20、30、40、50、60、70 ℃為試驗(yàn)點(diǎn)，每組三個(gè)平行，考察不同酶解溫度對(duì)葉綠素提取的影響，

1.2.3.5 混合酶酶解時(shí)間 參考實(shí)驗(yàn)步驟 1.2.3.4，固定酶解溫度為 50℃，以混合酶酶解時(shí)間1、2、3、4、5、6h為試驗(yàn)點(diǎn)，每組三個(gè)平行，考察不同酶解時(shí)間對(duì)葉綠素提取的影響。

1.2.3.6 料液比 參考實(shí)驗(yàn)步驟 1.2.3.4，固定酶解溫度為 50℃，酶解時(shí)間為 3h,以料液比 1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9、1∶10、1∶11、1∶12 為試驗(yàn)點(diǎn)，每組三個(gè)平行，考察不同料液比對(duì)葉綠素提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化。設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)，選取混合酶酶解溫度、混合酶酶解時(shí)間和料液比，分別以X1，X2 ，X3表示，每一個(gè)自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼，以葉綠素提取量（mg.g-1)為響應(yīng)值（Y），利用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定葉綠素最佳提取工藝[7-10]。實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析因子和水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 纖維素酶對(duì)葉綠素提取量的影響

圖1 纖維素酶對(duì)葉綠素提取量的影響Fig.1 Effects of cellulase on extraction yield of chlorophyll

從圖1可以看出，當(dāng)纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.2%～0.8%之間時(shí), 葉綠素的提取量隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，0.8%時(shí)葉綠素提取量達(dá)到最大，0.8%以后葉綠素的提取量隨著纖維素酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減少。可能是因?yàn)槔w維素酶用量較低時(shí)，纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞程度隨用量的增大而增大，細(xì)胞內(nèi)膜的通透性增大，葉綠素的提取量增大。當(dāng)超過(guò)最佳值時(shí)，造成纖維素酶分子過(guò)飽和,部分酶分子無(wú)法與底物結(jié)合，底物水解速度降低造成葉綠素提取量減少[11]。

圖2 果膠酶對(duì)葉綠素提取量的影響Fig.2 Effect of pectinase on extraction yield of chlorophyll

2.1.2 果膠酶對(duì)葉綠素提取量的影響從圖2可以看出，果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%時(shí)葉綠素的提取量最高。這是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)條件下,酶量低于最佳值時(shí)，酶解反應(yīng)未進(jìn)行完全；達(dá)最佳值時(shí)酶解反應(yīng)進(jìn)行較完全,此時(shí)如果繼續(xù)加大酶量,底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和導(dǎo)致酶的作用受到抑制[12]。

2.1.3 纖維素酶和果膠酶混合比例對(duì)葉綠素提取量的影響

圖3 混合酶比例對(duì)葉綠素提取量的影響Fig.3 Effect of Mixed enzyme proportion on extraction yield of chlorophyll

從圖3可以看出，不同質(zhì)量比的混合酶效果不相同，其中纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比為2:1時(shí)葉綠素的提取量最高。說(shuō)明復(fù)合酶兩者的協(xié)同作用可以加速甘蔗細(xì)胞結(jié)構(gòu)的崩解，改變細(xì)胞壁通透性，有利于葉綠素從細(xì)胞內(nèi)溶出。從而提高了葉綠素的提取量。因此，取最佳纖維素酶和果膠酶質(zhì)量比為2：1?？赡苁且?yàn)楦收峒?xì)胞壁中纖維素含量多于果膠的含量，也可能是因?yàn)槔w維素酶較果膠酶而言不容易充分發(fā)揮功效。

2.1.4 混合酶酶解溫度對(duì)葉綠素提取量的影響

圖4 混合酶酶解溫度對(duì)葉綠素提取量的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature of Mixed enzyme on extraction yield of chlorophyll

從圖4可以看出，開(kāi)始階段隨著溫度的升高，葉綠素提取量迅速升高，當(dāng)溫度達(dá)到 50℃時(shí)，葉綠素的提取量達(dá)到最大，50℃以后葉綠素的提取量呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)闇囟葘?duì)酶具有雙重作用。溫度升高時(shí)，酶的活化分子數(shù)增多，有利于酶催化反應(yīng)的進(jìn)行，酶解反應(yīng)速度加快，溫度繼續(xù)升高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酶變性失活，造成酶活性降低[13]。因此選擇混合酶反應(yīng)最佳溫度為50℃。

2.1.5 混合酶酶解時(shí)間對(duì)葉綠素提取量的影響

圖5 混合酶酶解時(shí)間對(duì)葉綠素提取量的影響Fig.5 Effect of enzymolysis time of Mixed enzyme on extraction yield of chlorophyll

從圖5可以看出，反應(yīng)時(shí)間在1～3h時(shí)，葉綠素的提取量隨時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速升高，3h時(shí)葉綠素提取量達(dá)到最大，3h后葉綠素提取量隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降。3h時(shí)葉綠素提取量達(dá)到最大值是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力得到充分利用，酶解反應(yīng)進(jìn)行得較完全，葉綠素提取量達(dá)到最大[14]。3h后葉綠素提取量逐漸下降是因?yàn)槿~綠素本身不穩(wěn)定，受周圍環(huán)境的影響，長(zhǎng)時(shí)間處于此環(huán)境中導(dǎo)致其分解。因此混合酶最佳反應(yīng)時(shí)間為3h。

2.1.6 料液比對(duì)葉綠素提取量的影響

圖6 料液比對(duì)葉綠素提取量的影響Fig.6 Effect of material to liquid ratio on extraction yield of chlorophyll

從圖6可以看出，當(dāng)料液比為1:7～1:8時(shí)，葉綠素的提取量隨著料液比的增加而升高，1:8時(shí)葉綠素提取量達(dá)到最大，1：8之后，葉綠素的提取量反而逐漸下降。這是因?yàn)楫?dāng)酶用量固定時(shí)，隨著料液比的增加，液體在甘蔗渣細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散能力增強(qiáng)，利于酶對(duì)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的降解，使細(xì)胞組織迅速被破壞，葉綠素得以釋放[15]。但隨著固液比的增加，酶的濃度隨之降低，葉綠素提取量也隨之降低。

2.2 響應(yīng)面分析法對(duì)生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素工藝的優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇混合酶酶解溫度（X1）、混合酶酶解時(shí)間（X2）、料液比(X3)為自變量，葉綠素提取量(Y)為響應(yīng)值，利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert.V8.0.6 設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)對(duì)生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 擬合回歸方程的建立

利用Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)表2 中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸擬合，得到葉綠素提取量( Y) 對(duì)混合酶酶解溫度( X1)、混合酶酶解時(shí)間( X2)、料液比( X3)3 個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

表3為以上二次多項(xiàng)回歸方程的方差分析和顯著性檢驗(yàn)結(jié)果。由表3可以看出回歸模型達(dá)到極顯著水平（0.01〉P=0.0005），失擬項(xiàng)不顯著( 0. 05 ＜P= 0.2080)，表明該二次多項(xiàng)回歸方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好，實(shí)驗(yàn)誤差小。并且該模型的R2= 95.74%，顯示該方程可靠性較高，C.V=4.12，C.V較低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好。綜上說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可以用于生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素實(shí)驗(yàn)條件的預(yù)測(cè)。由表3方差分析結(jié)果表明，方程的一次項(xiàng)X3和四個(gè)二次項(xiàng)X12，X22。X32，X1X3對(duì)方程的影響極顯著，一次項(xiàng)X1對(duì)方程的影響顯著，表明實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)甘蔗糖廠濾泥中葉綠素提取量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)因素的 F值可以反映出因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的重要性，F(xiàn)值越大，表明對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大，即重要性越大。從方差分析表可知：FX1=6.37，F(xiàn)X2=1.97，F(xiàn)X3=26.45，即各因素對(duì)葉綠素提取量的影響順序?yàn)椋篨3> X1> X2，即料液比影響最大，混合酶反應(yīng)溫度次之，最后為混合酶反應(yīng)時(shí)間。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

2.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程做出相應(yīng)的響應(yīng)面分析圖，來(lái)考察混合酶酶解溫度、混合酶酶解時(shí)間、液料比3個(gè)因素對(duì)生物酶解法提取葉綠素的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7-9。

圖7 混合酶酶解溫度與混合酶酶解時(shí)間對(duì)葉綠素提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of mixed enzyme temperature and Mixed enzyme time on the yield of chlorophyll

圖8 混合酶酶解溫度和料液比對(duì)葉綠素提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of mixed enzyme temperature and the ratio of material to liquid on the yield of chlorophyll

圖9 混合酶酶解時(shí)間和料液比對(duì)葉綠素提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of mixed enzyme time and the ratio of material to liquid on the yield of chlorophyll

2.2.4 最優(yōu)工藝條件的確定和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert.V8.0.6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行分析處理，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)為：混合酶酶解溫度49.35℃，混合酶酶解時(shí)間3.05h，料液比1∶8.29，在此最優(yōu)工藝條件下葉綠素的提取量為0.215 mg.g-1?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將工藝參數(shù)修正為：混合酶酶解溫度49℃，混合酶酶解時(shí)間 3h，料液比1：8，在此條件下進(jìn)行3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)的葉綠素提取量的平均值為0.211 mg.g-1，與理論值相比，其相對(duì)誤差為1.86%，說(shuō)明響應(yīng)面法優(yōu)化生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素工藝條件切實(shí)可行。按響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳生物酶解法提取條件和傳統(tǒng)溶劑法提取甘蔗糖廠濾泥中的葉綠素，比較兩種方法，結(jié)果見(jiàn)表4

表4 兩種方法的葉綠素提取結(jié)果對(duì)比Table 4 Comparison of extraction rates of chlorophyll extracted by two methods

從表 4 可知，生物酶解法提取的葉綠素的量均高于傳統(tǒng)溶劑提取法，通過(guò)計(jì)算平均值可以看出生物酶解法提取的葉綠素的量比傳統(tǒng)溶劑法高出8%左右。

3 結(jié)論

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明各因素指標(biāo)之間的關(guān)系不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。通過(guò)響應(yīng)面法分析可知，混合酶酶解溫度、混合酶酶解時(shí)間、液料比3個(gè)因素對(duì)葉綠素提取量的效應(yīng)趨勢(shì)，液料比對(duì)葉綠素提取量影響較大，混合酶酶解溫度次之，最后為混合酶酶解時(shí)間。通過(guò)回歸方程優(yōu)化得出生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素的最佳工藝為：混合酶酶解溫度 49℃，混合酶酶解時(shí)間3h，料液比1:8。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)能充分發(fā)揮纖維素酶和果膠酶的酶解作用，有效提高甘蔗糖廠濾泥中葉綠素的提取量。采用響應(yīng)面分析法得到的生物酶解法提取甘蔗糖廠濾泥中葉綠素工藝準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值，為其在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

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