孫 敏，于海奕，張幼怡，呂志珍，高 煒，李子健

（北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科血管醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

成年大鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)及興奮-收縮耦聯(lián)表征

孫 敏，于海奕，張幼怡，呂志珍，高 煒，李子健

（北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科血管醫(yī)學(xué)研究所，衛(wèi)生部心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191）

目的 比較兩種細(xì)胞分離液分離成年大鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)一步表征成年大鼠心室肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)。方法 Langendorff裝置進(jìn)行主動(dòng)脈逆流灌流，分別用兩種細(xì)胞分離液分離成年大鼠心肌細(xì)胞，無血清培養(yǎng)并進(jìn)行腺病毒感染。顯微鏡下觀察單個(gè)心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，熒光顯微鏡下檢測(cè)病毒感染。采用IonOptix儀器檢測(cè)心肌細(xì)胞肌節(jié)收縮-舒張指標(biāo)以及心肌細(xì)胞鈣離子攝入-排出指標(biāo)。結(jié)果 兩種分離液均可獲得70％橫紋清晰的長桿狀心肌細(xì)胞，培養(yǎng)可存活7 d以上。腺病毒感染48 h，綠色熒光蛋白持續(xù)表達(dá)7 d以上。分離液一獲得的心肌細(xì)胞不能很好地隨電場刺激產(chǎn)生收縮，分離液二獲得的細(xì)胞可用于檢測(cè)興奮-收縮耦聯(lián)特性，心肌細(xì)胞肌節(jié)縮短分?jǐn)?shù)為11.61％±2.15％，舒張時(shí)間為（0.177±0.031）s，鈣瞬變幅度為30.79％ ±9.74％，鈣瞬變衰減時(shí)間為（0.300±0.074）s。結(jié)論 兩種分離液均可用于分離和培養(yǎng)成年大鼠心肌細(xì)胞，并用于腺病毒轉(zhuǎn)染等長時(shí)程研究。分離液二更適用于檢測(cè)成年大鼠心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)特性。

心肌細(xì)胞；成年大鼠；分離；培養(yǎng)；興奮-收縮耦聯(lián)

目前，心肌細(xì)胞是心臟疾病研究主要應(yīng)用的細(xì)胞模型，乳鼠心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)的技術(shù)方法非常成熟并被廣泛接受。但是乳鼠心肌細(xì)胞與成體心肌細(xì)胞相比，其結(jié)構(gòu)和功能都存在極大的差異，尤其是利用乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)來研究心肌細(xì)胞電生理存在著很大的局限性，因此人們開始探索成體心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

自1976年P(guān)owell T和Twist VW［1］首次建立了單個(gè)成年心肌細(xì)胞分離方法后，成年心肌細(xì)胞被廣泛地用于心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)、鈣信號(hào)變化、力學(xué)特性、藥物干預(yù)、基因治療等研究中［2］。但成熟心肌細(xì)胞分離和培養(yǎng)的技術(shù)、條件要求較高，使得成熟心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)成功率極低。酶解法用于成年大鼠的心肌細(xì)胞分離已有近40年的歷史，但至今仍無統(tǒng)一的細(xì)胞產(chǎn)率高、活性好的簡便的方法，進(jìn)而制約了成年心肌細(xì)胞在細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

為此，本研究通過比較目前常用的兩種成年大鼠心肌細(xì)胞分離方法在心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)檢測(cè)中的應(yīng)用，擬建立一套細(xì)胞產(chǎn)率高、鈣耐受性好的成年大鼠心肌細(xì)胞快速分離及培養(yǎng)方法，可進(jìn)行穩(wěn)定的腺病毒感染，并對(duì)成年大鼠心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)進(jìn)行表征。本研究為深入理解心肌細(xì)胞力學(xué)特性和相關(guān)心血管疾?。ㄈ缧乃サ龋┨峁┝嘶A(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

6～8周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠，180～200 g，6只，來源于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；使用許可證號(hào)：SYXK （京）2011-0039】。主要試劑：II型膠原酶、Fura-2、層纖連蛋白（Laminin）：Invitrogen公司；蛋白酶、2，3-丁二酮一肟（BDM）、Medium 199：Sigma公司。

心肌細(xì)胞分離液一［3］：200 mL無鈣臺(tái)式液：NaCl 1.601 g，KCl 0.081 g，NaH2PO4·2H2O 0.037 g，Glucose·H2O 0.396 g，Taurine 0.250 g，Hepes 0.953 g，MgCl2·6H2O 0.049 g，超純水定容至200 mL，NaOH（2 mol/L）調(diào)pH值在7.20～7.30范圍內(nèi)。酶液I：臺(tái)式液15 mL，BSA 15 mg，BDM 15 mg，Taurine 15 mg，膠原酶II8.1mg，蛋白酶1.3 mg。酶液II：臺(tái)式液10 mL，BSA 10mg，BDM 10 mg，Taurine 10 mg，膠原酶II 5.4 mg。酶液III：臺(tái)式液10 mL，BSA 10 mg，BDM 10 mg，Taurine 10 mg，膠原酶II 5.4 mg。心肌細(xì)胞分離液二［4］：200 mL無鈣臺(tái)式液：NaCl 1.403 g，KCl 0.082 g，NaH2PO4·2H2O 0.010 g，Glucose·H2O 0.871 g，Taurine 0.248 g，Hepes 1.192 g，MgCl2·6H2O 0.020 g，超純水定容至200 mL，NaOH（2 mol/L）調(diào)pH值在7.20～7.30范圍內(nèi)。酶I：無鈣臺(tái)式液35mL，膠原酶II30mg，蛋白酶3 mg，CaCl2（0.2 mol/L）8.75μL。酶II：酶I 15 mL，CaCl2（0.2 mol/L）18.75μL。酶III：酶I15 mL，CaCl2（0.2 mol/L）48.75μL，BSA 30 mg。Buffer A：無鈣臺(tái)式液85 mL，EGTA（0.4 mol/L）85 μL。Buffer B：無鈣臺(tái)式液80 mL，CaCl2（0.2 mol/L）400μL，BSA 160 mg。所有灌流液需用0.22μm無菌濾膜過濾除菌，經(jīng)純氧飽和30 min后使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌細(xì)胞的分離：取SD大鼠，腹腔注射肝素1000 U/kg，30 min后戊巴比妥鈉腹腔麻醉（50 mg/kg）。參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行分離［5］，迅速開胸，于主動(dòng)脈根部處取心臟懸掛。Buffer A灌流3 min，換酶I灌流。酶I灌流完畢換酶II灌流，同時(shí)開始酶液循環(huán)灌流。至心肌組織變軟時(shí)結(jié)束消化，將組織剪下置于酶III中，剪碎，酶III消化-離心（500 r/min，1 min）-Buffer B重懸，重復(fù)這一過程，直至組織處理完成。用200目濾網(wǎng)過濾去除殘余組織塊，靜置10 min，細(xì)胞自然降沉，棄上清，再加入Buffer B液自然降沉。吸棄上清，取10 mL Buffer B液，加入CaCl2（0.2 mol/L）25μL，自然降沉10min。吸棄上清，取10 mL Buffer B液，加入CaCl2（0.2 mol/L）40 μL，自然降沉10 min。使梯度復(fù)鈣最終濃度為1.8 mmol/L，置于室溫2 h備用。

1.2.3 大鼠心室肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)檢測(cè)：DMSO溶解Fura-2粉末，終濃度1 mmol/L。取1 mL細(xì)胞懸液于EP管內(nèi)，錫箔紙包裹避光，加入Fura-2溶液1μL。室溫靜置孵育20 min。EP管底部可見小塊沉淀，吸棄上清，加入新鮮臺(tái)式液1 mL，混勻。室溫靜置5 min后重復(fù)洗滌一次。靜置20 min后上機(jī)檢測(cè)。使用IonOptix（IonOptixCo，USA）系統(tǒng)檢測(cè)心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)表征。給予細(xì)胞1 Hz，4 ms波寬，幅度15 V的電場刺激。實(shí)時(shí)采集并記錄心肌細(xì)胞肌節(jié)收縮-舒張指標(biāo)以及心肌細(xì)胞鈣離子攝入-排出指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 兩種分離液獲得的心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

本研究采用的兩種心肌細(xì)胞分離液均可分離出單個(gè)成年大鼠心肌細(xì)胞，且分離出的心肌細(xì)胞數(shù)量與形態(tài)相當(dāng)。每個(gè)大鼠心臟可獲得1×107個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞的桿狀率達(dá)70％。倒置顯微鏡下可見鈣耐受細(xì)胞為長桿狀或矩形，橫紋清晰，排列規(guī)則，邊緣銳利，折光性好，大部分為靜息狀態(tài)（圖1）。

圖1 兩種分離液獲得成年大鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)Note：A，Themorphological features of cardiomyocytes obtained by the first separation medium；B，Themorphological features of cardiomyocytes obtained by the second separation medium；bar=200μm.Fig.1 Themorphological features of cardiomyocytes obtained by two different separation medium

2.2 心肌細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間及病毒轉(zhuǎn)染效率鑒定

將兩種分離液獲得的單個(gè)心肌細(xì)胞接種到Laminin包被的培養(yǎng)皿中，心肌細(xì)胞均能貼壁生長，存活長達(dá)14 d（彩插1圖2）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的成年大鼠心肌細(xì)胞能否用于長時(shí)程分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，心肌細(xì)胞接種到Laminin包被的培養(yǎng)皿1 h后換液，進(jìn)行病毒感染。本研究發(fā)現(xiàn)，感染攜帶綠色熒光蛋白基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體（AdGFP）24 h后可見熒光顯微鏡下綠色熒光蛋白表達(dá)，熒光強(qiáng)度低。感染48 h后綠色熒光蛋白表達(dá)率達(dá)90％，熒光強(qiáng)度高。培養(yǎng)7 d后仍能檢測(cè)到綠色熒光蛋白表達(dá)（彩插1圖2）。

2.3 兩種分離液獲得成年大鼠心室肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)表征的比較

在給予1 Hz，4 ms波寬，幅度15 V的電場刺激下，心肌細(xì)胞分離液一分離出的心肌細(xì)胞不能隨電刺激的頻率發(fā)生節(jié)律性收縮，IonOptix儀器記錄的肌節(jié)舒縮和鈣信號(hào)圖形為圍繞基線產(chǎn)生的噪音信號(hào)，表明心肌細(xì)胞失去興奮收縮耦聯(lián)特性（圖3 A）。心肌細(xì)胞分離液二分離出的心肌細(xì)胞能夠隨電刺激的頻率發(fā)生節(jié)律性收縮，IonOptix儀器可實(shí)時(shí)檢測(cè)和記錄成年心肌細(xì)胞肌節(jié)舒縮和鈣信號(hào)圖形（圖3 B）。

統(tǒng)計(jì)6只大鼠、15個(gè)心肌細(xì)胞肌節(jié)收縮-舒張指標(biāo)以及心肌細(xì)胞鈣離子攝入-排出指標(biāo)，反映心室肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)表征，發(fā)現(xiàn)單個(gè)成年大鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)縮短分?jǐn)?shù)為11.61％ ±2.15％，舒張時(shí)間為（0.177±0.031）s，鈣瞬變幅度為 30.79％ ± 9.74％，鈣瞬變衰減時(shí)間為（0.300±0.074）s。

3 討論

目前，成年心肌細(xì)胞的分離主要為Langendorff逆行主動(dòng)脈生物酶灌流消化方法。不同實(shí)驗(yàn)室采用的分離液不盡相同，且分離出的細(xì)胞是否適合興奮-收縮耦聯(lián)特性的檢測(cè)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。本研究比較了文獻(xiàn)報(bào)道中主要采用的分離液一以及分離液二，發(fā)現(xiàn)兩種分離液在細(xì)胞產(chǎn)量及活性方面無明顯差異。分離液二的操作更簡單、快速，且獲得的心肌細(xì)胞適于進(jìn)行興奮-收縮耦聯(lián)特征的檢測(cè)。

兩種成年大鼠心肌細(xì)胞分離液最大的不同在于消化酶中是否含有BDM（butanedionemonoxime）。本研究發(fā)現(xiàn)，兩種分離液獲得心肌細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量并無明顯差異，但含有BDM的消化酶分離的心肌細(xì)胞對(duì)電刺激的反應(yīng)性不良，甚至無反應(yīng)，不會(huì)隨電刺激的頻率發(fā)生節(jié)律性收縮。BDM是肌球蛋白ATP酶抑制劑，能夠抑制橫橋的形成，進(jìn)而抑制肌絲的收縮和能量代謝。以往研究在酶液中加入高濃度BDM，用以抑制分離過程中心臟過度收縮、減輕缺血再灌注損傷以及維持心臟低能量代謝狀態(tài)，進(jìn)而提高心肌細(xì)胞產(chǎn)量［6］。但是BDM能夠影響細(xì)胞膜離子通道活性及相關(guān)信號(hào)傳遞［7-9］、以及細(xì)胞縫隙連接［10］，從而阻礙心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)的形成，因此建議進(jìn)行心肌細(xì)胞興奮收縮耦聯(lián)特征檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)心肌細(xì)胞的分離消化液中應(yīng)不加BDM。

圖3 IonOptix儀器檢測(cè)和記錄成年大鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)舒縮變化和鈣信號(hào)改變Note：A，The figure of the shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium of cardiomyocytes isolated by the first separation medium；B，The figure of the shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium of cardiomyocytes isolated by the second separation medium.Fig.3 The shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium of adult rat cardiomyocytes isolated by two different separation medium

本研究總結(jié)出在成年大鼠心肌細(xì)胞分離過程中應(yīng)注意以下事項(xiàng)：①灌流液的pH值在7.20～7.30范圍內(nèi)：本研究方法用純氧進(jìn)行灌流液氧飽和。而部分文獻(xiàn)報(bào)道灌流液的pH值為7.40，配以體積分?jǐn)?shù)為95％O2+5％CO2混合氣體進(jìn)行氧合，但此法不好控制pH值與氧飽和時(shí)間的平衡，易使溶液pH值過低；②灌流液流出端口溫度保持在37℃：由于恒溫水浴泵顯示的溫度為水槽內(nèi)的溫度，經(jīng)過Langendorff管路后實(shí)際溫度低于37℃，降低酶的效力，因此應(yīng)根據(jù)出口端的溫度調(diào)整恒溫水浴泵的溫度，保證進(jìn)入心臟的酶的效力；③酶液濃度：目前廣泛用于解離細(xì)胞間結(jié)締組織的消化酶是Ⅱ型膠原酶。胰蛋白酶主要用于分解組織間質(zhì)的蛋白成分，同時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞膜蛋白有破壞作用。因此本實(shí)驗(yàn)采用較低的蛋白酶濃度（0.086 g/L）和較高的膠原酶濃度（0.86 g/L）進(jìn)行快速消化，酶消化總時(shí)間為20min，減少了酶對(duì)細(xì)胞的破壞，提高細(xì)胞產(chǎn)率；④其他：取下心臟到開始主動(dòng)脈逆行灌流的時(shí)間不應(yīng)超過1 min，所有液體均采用超純水配制，換液體灌流時(shí)注意要暫停恒流泵以防灌流液中產(chǎn)生氣泡，全過程液體流速控制在6 mL/min，整個(gè)操作（尤其是吹打）過程動(dòng)作應(yīng)輕柔。

本研究進(jìn)一步通過心肌細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染驗(yàn)證獲得的心肌細(xì)胞能否適用于實(shí)驗(yàn)研究。成年心肌細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵在于是否能分離出高比例的長桿狀鈣耐受細(xì)胞。有些文章用臺(tái)盼藍(lán)染色來檢測(cè)細(xì)胞的存活率［11］，但這一方法有一定的局限性。因?yàn)榧毙苑蛛x過程中受到應(yīng)激的細(xì)胞能夠使臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在培養(yǎng)的過程中，這些細(xì)胞有可能從應(yīng)激中恢復(fù)并很好地存活［12］。判斷細(xì)胞活性最可靠的指標(biāo)是光鏡下可見四角銳利、橫紋清晰、長桿狀，并能對(duì)電刺激產(chǎn)生收縮反應(yīng)［13］。本研究采用的兩種分離液均能穩(wěn)定地獲取高產(chǎn)率、高活性的成年大鼠心肌細(xì)胞，并能進(jìn)行長時(shí)間培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞可以穩(wěn)定地感染腺病毒，感染效率達(dá)90％，因此兩種分離液獲得的成年大鼠心肌細(xì)胞均可用于進(jìn)行目的基因的過表達(dá)或敲減，進(jìn)而研究目的基因?qū)τ谛募〖?xì)胞功能的影響。

在一次興奮-收縮耦聯(lián)的過程中，心肌細(xì)胞的肌節(jié)隨電刺激有規(guī)律地收縮和舒張，同時(shí)伴隨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變［14］。IonOptix儀器可以同步記錄單個(gè)成年大鼠心肌細(xì)胞肌節(jié)舒縮活動(dòng)和鈣信號(hào)變化。本研究采用單細(xì)胞動(dòng)緣技術(shù)，用bl％peak h和sin exp tau兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析。peak h代表心肌細(xì)胞的收縮幅度，由于細(xì)胞本身大小有差異，收縮幅度也不同，因此為排除細(xì)胞大小造成收縮力的差異，本研究采取心肌細(xì)胞收縮幅度與單個(gè)心肌細(xì)胞長度的百分比（bl％peak h）進(jìn)行校正，更準(zhǔn)確地反映心肌細(xì)胞的收縮能力。sin exp tau代表細(xì)胞某一功能呈指數(shù)衰減所需的時(shí)間，在一次興奮-收縮耦聯(lián)過程中，反映肌節(jié)舒張和肌漿網(wǎng)鈣離子再攝取的速度。

總之，本研究通過兩種分離液的比較，建立了一套穩(wěn)定、高產(chǎn)率且適用于興奮-收縮耦聯(lián)檢測(cè)的成年大鼠心肌細(xì)胞分離方法。并經(jīng)過心肌細(xì)胞培養(yǎng)和病毒感染的驗(yàn)證，證明此方法培養(yǎng)的成年大鼠心肌細(xì)胞可用于常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)和功能研究。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用IonOptix儀器對(duì)分離的成年大鼠心肌細(xì)胞的單細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)的表征進(jìn)行了檢測(cè)，為今后成年心肌細(xì)胞用于心臟電生理研究和分子生物學(xué)研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Isolation and culture of adult rat cardiom yocytes and characteristics of excitation-contraction coupling

SUN Min，YU Hai-yi，ZHANG You-yi，LV Zhi-zhen，GAOWei，LIZi-jian
（Department of Cardiology，Peking University Third Hospital，Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides，Ministry of Health，Key Laboratory of Molecular Cardiovascular Sciences，Ministry of Education，Beijing 100191，China）

Objective To compare two separation medium of isolation of adult rat cardiomyocytes，and to observe the characteristics of excitation-contraction coupling of cardiomyocytes.M ethods The isolated adult rat heartwas hanged on to the Langendorff apparatus for aortic counter-current perfusion and collagenase digestion using two different separation medium.The single cardiomyocytes were cultured and infected with adenovirus.The morphological features of cardiomyocytes were observed with microscope and fluorescent microscope.The shortening-re-lengthening features of sarcomere and the intake-discharge features of calcium were simultaneously recorded by IonOptix equipment.Results 70％rod-shaped with clear-striation adult rat cardiomyocytes could be obtained with the stated two separation medium and cultured in serum-freemedium formore than 7 days.GFP could expressmore than 7 days when the cardiomyocytes were infected with adenovirus.Cardiomyocytes obtained by the first separation medium could not contract with the electrical stimulation，while cardiomyoctyes obtained by the second separation medium could be used for the detection of excitation-contraction coupling.The shortening fraction of sarcomere was 11.61％ ±2.15％and the relaxing time was（0.177± 0.031）s.The amplitude of calcium transient was 30.79％ ±9.74％and the decaying time of calcium transient was （0.300±0.074）s.Conclusion With the stated two separationmedium，adult rat cardiomyocytes can be well isolated，cultured and infected with adenovirus.The second separationmedium can be used for the detection ofexcitation-contraction coupling characteristics.

Cardiomyocyte；Adult rat；Isolation；Culture；Excitation-contraction coupling

R332

A

1671-7856（2014）03-0001-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.001

國家自然科學(xué)基金（81100164、81070078、81270157）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專向科研基金（20100001110101、20110001120015）。

孫敏（1988-），女，碩士生。E-mail：sunmin0602@163.com。

李子?。?970-），男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事心血管基礎(chǔ)研究。E-mail：lizijian@bjmu.edu.cn。

2014-01-15

研究報(bào)告