高 凱，王德軍，嚴(yán)茂祥，陳芝蕓

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

IGF-1、IGFBP-3在大鼠非酒精性脂肪性肝病進(jìn)展中的變化

高 凱1，王德軍2，嚴(yán)茂祥1，陳芝蕓1

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，杭州 310006；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053）

目的 觀察非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠血清胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（IGFBP-3）的表達(dá)及多烯磷脂酰膽堿對(duì)其的影響。方法 采用高脂飼料喂養(yǎng)建立大鼠NAFLD模型，以多烯磷脂酰膽堿進(jìn)行干預(yù)。HE染色動(dòng)態(tài)觀察大鼠4、8、12周時(shí)肝組織病理學(xué)變化，IRMA法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清IGF-1、IGFBP-3含量。結(jié)果 正常組大鼠各時(shí)間點(diǎn)肝組織病理均無明顯異常；模型組隨高脂飲食時(shí)間延長(zhǎng)，在4、8、12周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)肝組織脂肪變、炎癥程度、氣球樣變及NAFLD活動(dòng)度積分逐漸增強(qiáng)，血清IGF-1、IGFBP-3逐漸明顯下降，且模型組各時(shí)相點(diǎn)IGF-1、IGFBP-3的水平較正常組同一時(shí)相點(diǎn)明顯降低；應(yīng)用多烯磷脂酰膽堿干預(yù)后，大鼠肝組織炎癥程度、NAFLD活動(dòng)度積分較模型組顯著降低，IGF-1、IGFBP-3的水平則較模型組明顯增高。結(jié)論 血清IGF-1、IGFBP-3水平隨大鼠NAFLD進(jìn)展而降低。

非酒精性脂肪性肝?。灰葝u素樣生長(zhǎng)因子1；胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3；多烯磷脂酰膽堿

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見慢性肝病，脂質(zhì)代謝紊亂尤其是肝內(nèi)脂質(zhì)代謝障礙是其發(fā)生發(fā)展的前提和必需，胰島素樣生長(zhǎng)因子 1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）能夠促進(jìn)脂肪合成，抑制脂肪分解，降低血液中游離脂肪酸（free fat acids，F(xiàn)FA）的濃度，主要由肝臟合成，發(fā)揮作用依賴于游離IGF與其受體結(jié)合，而約99％IGF都與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor binding protein，IGFBP）以結(jié)合形式存在［1］，因此，IGF-1及IGFBP在NAFLD中的作用值得關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察成年NAFLD大鼠血清中IGF-1、IGFBP-3的變化及多烯磷脂酰膽堿對(duì)其的影響，探討二者在NAFLD發(fā)病中的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠70只，成年雄性，清潔級(jí)，體重200±10 g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)碼：【SCXK（滬）2008-0016】。無菌手術(shù)操作在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行【SYXK（浙）2008-0184】。

1.2 主要試劑及藥品

膽固醇由上海博奧生物科技有限公司提供，批號(hào)：100901；膽鹽由杭州微生物試劑有限公司提供，批號(hào)：20100421；多烯磷脂酰膽堿為德國(guó) A.Nattermann＆Cie.GmebH產(chǎn)品，規(guī)格：228 mg/片，批號(hào)：46940B。IGF-1、IGFBP-3免疫放射分析（immuno radiometric assay，IRMA）試劑盒均由美國(guó)Diagnostic Systems Laboratories Inc 提 供，批號(hào)：01197。

1.3 主要儀器

MICROM STR120自動(dòng)組織脫水機(jī)、MICROM HM335E半自動(dòng)石臘切片機(jī)為德國(guó)MICROM公司產(chǎn)品，LEICARM 2025病理切片機(jī)為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品，Nikon50I光學(xué)顯微鏡為日本Nikon公司產(chǎn)品，SN-697γ計(jì)數(shù)儀為上海核所日環(huán)光電儀器有限公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

70只大鼠隨機(jī)分為正常組30只，模型組30只，多烯磷脂酰膽堿組10只，正常組及模型組又分為4周、8周、12周3個(gè)時(shí)相點(diǎn)；正常組以普通標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，模型組及多烯磷脂酰膽堿組均以高脂飼料（由普通標(biāo)準(zhǔn)飼料82％、豬油10％、蛋黃粉5％、膽固醇2％及膽鹽1％組成）喂養(yǎng)；多烯磷脂酰膽堿組在造模的同時(shí)按照臨床成人劑量的10倍（195.40 mg/kg·d）灌服多烯磷脂酰膽堿12周。末次給藥當(dāng)晚禁食不禁水，次日上午空腹麻醉下取血，分離血清，用IRMA法檢測(cè)血清IGF-1、IGFBP-3含量；取肝組織，以4％多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，HE染色，肝組織的脂肪變、炎癥程度、氣球樣變?cè)\斷以及NAFLD活動(dòng)度積分（NAFLD activity score，NAS）參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組等制訂的“非酒精性脂肪性肝病診療指南（2010年修訂版）”［2］。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠病理組織學(xué)變化

光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，正常組無明顯異常。模型組肝組織脂肪變、炎癥程度、氣球樣變以及NAS隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，模型8周時(shí)NAS較模型4周時(shí)增高（P＜0.01）；模型12周時(shí)炎癥程度、氣球樣變、NAS較模型4周和8周時(shí)均顯著增高（P＜0.05，P＜0.01），脂肪變程度較模型4周時(shí)顯著增高（P＜0.01）。干預(yù)組炎癥程度、NAS較模型組12周明顯降低（P＜0.05）（表1、2）。

2.2 各組大鼠血清IGF-1、IGFBP-3的變化

正常組、模型組血清IGF-1、IGFBP-3均隨著大鼠周齡增加而降低。各時(shí)間點(diǎn)模型組均較相應(yīng)正常組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）（表3）。應(yīng)用多烯磷脂酰膽堿干預(yù)后，血清IGF-1、IGFBP-3較模型組12周顯著升高（P＜0.05）（表4）。

表1 NAFLD大鼠肝臟病理組織學(xué)動(dòng)態(tài)變化Tab.1 Dynamical changes of NAFLD rats’liver pathological histology

表2 多烯磷脂酰膽堿對(duì)NAFLD大鼠肝臟病理組織學(xué)影響Tab.2 Impact of polyene phosphatidyl choline to NAFLD rats’liver pathological histology

3 討論

肝臟參與脂肪代謝并在其中起重要作用，其合成的脂肪會(huì)運(yùn)輸?shù)狡渌M織分解利用或者儲(chǔ)存到脂肪組織，正常情況下肝臟內(nèi)不會(huì)形成脂質(zhì)沉積。NAFLD形成的一個(gè)重要先決條件是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積特別是甘油三酯沉積，其發(fā)生原因目前尚未完全明確，可能包括脂質(zhì)攝入異常導(dǎo)致肝臟FFA輸入增加、線粒體代謝障礙導(dǎo)致FFA更多轉(zhuǎn)化為甘油三酯、FFA及甘油三酯合成增加和肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯運(yùn)出減少，這些因素單獨(dú)或協(xié)同造成肝臟脂質(zhì)代謝的消化吸收、轉(zhuǎn)化合成、氧化分解和運(yùn)輸分泌的失衡［3］，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)異常沉積特別是甘油三酯的異常沉積，進(jìn)而發(fā)生NAFLD，這個(gè)過程會(huì)導(dǎo)致脂肪性肝病發(fā)生炎癥、壞死和纖維化。多烯磷脂酰膽堿膠囊內(nèi)含亞油酸及亞麻酸、油酸，能將中性脂肪和膽固醇轉(zhuǎn)化成易代謝的形式，促進(jìn)肝組織再生，可恢復(fù)肝功能和受損的酶活力，目前臨床上常用來治療NAFLD。

胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）包括IGF-1和2，屬于胰島素樣生長(zhǎng)因子家族（IGFs），其中只有約1％以游離形式存在，與相應(yīng)受體結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮作用，其余99％則與IGFBP結(jié)合。IGFBP既是體內(nèi)IGF的主要運(yùn)輸載體，同時(shí)也是機(jī)體賴以調(diào)控IGF活性的主要途徑和方法［4］。IGF-1是由70個(gè)氨基酸組成的多肽，與胰島素原有一半相同序列，血液中的IGF-1主要有賴肝臟合成。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1具有類似胰島素樣作用，在外周組織能促進(jìn)糖原、蛋白質(zhì)和脂肪的合成，降低血液中游離氨基酸、脂肪酸濃度；抑制凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖；與腫瘤、骨質(zhì)疏松、腎臟疾病、糖尿病、冠心病、腦梗死等的發(fā)生發(fā)展及治療有關(guān)［5］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加IGF-1可對(duì)脂肪肝肝細(xì)胞線粒體起到一定保護(hù)作用，阻斷活性氧（與再灌注損傷有關(guān)）的產(chǎn)生［6］。正常情況下，約80％IGF-1與IGFBP-3結(jié)合，IGF-1作用的發(fā)揮與IGFBP-3的水平密切相關(guān)，隨著年齡的增加，游離IGF-1的水平和活性下降［7］，IGFBP-3水平也會(huì)下降。彭乃寶等［8］通過檢測(cè)肝硬化患者與正常志愿者的血清 IGF-1、IGFBP-3水平，認(rèn)為在肝硬化患者中，隨著病情加重，肝臟合成和分泌IGF-1、IGFBP-3的能力下降。國(guó)外有人通過臨床試驗(yàn)檢測(cè)NAFLD患者谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶比值、血小板計(jì)數(shù)、IGF-1在肝纖維化不同分期的水平變化，發(fā)現(xiàn)在肝纖維化早期，IGF-1、IGF-1/IGFBP-3較晚期高，認(rèn)為低水平的IGF-1及IGF-1/IGFBP-3可能與NAFLD肝纖維化有關(guān)［9］。

本實(shí)驗(yàn)中，正常組、模型組大鼠血清 IGF-1、IGFBP-3均隨周齡增加而降低，表明隨年齡增加，二者合成下降。高脂飼料喂養(yǎng)后，大鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的脂肪變、炎癥和氣球樣變，NAS增加，且隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)差異更加明顯；同時(shí)血清IGF-1、IGFBP-3水平較同一時(shí)相點(diǎn)正常組均顯著下降，且隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)下降更加明顯。推測(cè)NAFLD發(fā)生后，肝細(xì)胞合成IGF-1功能下降，IGF-1水平的降低一方面對(duì)自身線粒體保護(hù)作用減弱，另一方面造成機(jī)體血液中FFA進(jìn)一步增加，從而使肝組織脂質(zhì)代謝紊亂加重，炎癥、纖維化發(fā)生，NAFLD進(jìn)一步進(jìn)展，從而形成惡性循環(huán)。多烯磷脂酰膽堿干預(yù)后，大鼠肝組織炎癥程度、NAS明顯減輕（P＜0.05），血清IGF-1、IGFBP-3的水平均較模型組顯著提高（P ＜0.05），表明多烯磷脂酰膽堿一定程度上可改善肝細(xì)胞合成IGF-1的功能，緩解和改善肝內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂的情況，起到治療作用。研究提示，血清IGF-1、IGFBP-3的低水平與NAFLD疾病本身的進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)，二者可作為疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)因子，進(jìn)而為NAFLD的診斷及其相關(guān)疾病的治療提供參考性依據(jù)。

［1］潘逸茹，薛惠君，龔立琪.胰島素樣生長(zhǎng)因子-I在非酒精性脂肪肝病變中的變化［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2005，20（4）：300-302.

［2］范建高，賈繼東，陳力元，等.非酒精性脂肪性肝病診療指南［J］.中華肝臟病雜志，2010，18（3）：163-166.

［3］陸再英，鐘南山，謝毅，等.非酒精性脂肪性肝?。跰］.內(nèi)科學(xué)，人民衛(wèi)生出版社，ISBN 978-7-117-09652-2，2010：435-437.

［4］Delafontaine P，Song YH，Li Y.Expression，regulation，and function of IGF-1，IGF-1R，and IGF-1 binding proteins in blood vessels［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24（3）：435-444.

［5］楊彬.胰島素樣生長(zhǎng)因子1的研究進(jìn)展［J］.廣西醫(yī)學(xué)，2002，24（8）：1198-1201.

［6］ZaoualiMA，Padrissa-Altés S，Ben Mosbah I，et al.Insulin like growth factor-1 increases fatty liver preservation in IGL-1 solution［J］.World J Gastroenterol，2010，16（45）：5693 -5700.

［7］張秀梅，陸衛(wèi)平.2型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病患者IGF -1與胰島素抵抗關(guān)系研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12 （10）：1998-2000.

［8］彭乃寶，萬榮.肝硬化患者血清IGF-1及其IGFBP-3測(cè)定與肝功能狀況的關(guān)系［J］.右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005（2）：146-149.

［9］Ichikawa T，Nakao K，Hamasaki K，et al. Role of growth hormone，insulin-like growth factor 1 and insulin-like growth factor-binding protein 3 in developmentofnon-alcoholic fatty liver disease［J］.Hepatol Int，2007，1（2）：287-294.

The variation of IGF-1，IGFBP-3 in the development of rats’non-alcoholic fatty liver disease

GAO Kai1，WANG De-jun2，YAN Mao-xiang1，CHEN Zhi-yun1
（1.The first affiliated hospital of Zhejiang Traditional Chinese Medicinal University，Hangzhou 310006，China；2.Zhejiang Traditional Chinese Medicinal University，Hangzhou 310053，China）

Objective To observe the expression of insulin-like growth factor1（IGF-1），insulin-like growth factor binding protein 3（IGFBP-3）in rats’serum with non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）and the impact of Polyene phosphatidyl choline.M ethods NAFLD model was induced by feeding the SD rats with a high-fat diet，with Polyene phosphatidyl choline to intervene.Observe the pathological changes of the rats’liver tissue dynamically after HE staining.Detect the contents of IGF-1，IGFBP-3 in serum dynamically through the immuno radio metric assay（IRMA）.Resu lts There were no obvious exception of the liver tissue pathology in the normal group ateach time.With the extension of a highfat diet，the liver tissue of themodel group increased on fatty change，the degree of inflammation，the balloon sample change，the NAFLD activity score at 4，8，12weeks.IGF-1，IGFBP-3 in serum were decreased significantly，and the model set was significantly lower than the normalgroup at the same phase.After the application of polyene phosphatidyl choline，the degree of rat liver tissue inflammation and the NAFLD activity score were reduced significantly when compared with model group，while the level of IGF-1，IGFBP-3were significantly higher.Conclusion The levels of IGF-1，IGFBP-3 in the rats’serum reduce in the development of non-alcoholic fatty liver disease.

NAFLD；IGF-1；IGFBP-3；Polyene phosphatidyl choline

R332

A

1671-7856（2014）03-0006-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.002

浙江省自然基金資助項(xiàng)目（Y2100170）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013ZB044）。

高凱（1988-），男，碩士生，研究方向：消化系統(tǒng)疾病。

陳芝蕓（1953-），女，醫(yī)學(xué)碩士，研究員，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：脂肪性肝病、胃癌前病變及功能性胃腸病等方面。

2014-01-20

研究報(bào)告