王麗琴，馮 坤，孫 利

(上海市口腔病防治院口腔內(nèi)科，上海 200031)

牙周病是口腔兩大類主要疾病之一，在世界范圍內(nèi)均有較高的患病率。目前，牙周疾病是引起牙周組織缺損最終導(dǎo)致牙齒缺失的最常見病因。因此，對(duì)牙周病病因、發(fā)展以及臨床治療的研究具有相當(dāng)現(xiàn)實(shí)的意義?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)。MMPs分為5大類:膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、膜型MMPs以及結(jié)構(gòu)和功能比較特殊的MMPS。基質(zhì)金屬蛋白酶的主要生理性抑制劑基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase，TIMPs)，是一個(gè)低分子量分型蛋白質(zhì)家族，目前已確定了4種TIMPs(TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3 和 TIMP-4)，每一種都可與MMPs以共價(jià)鍵形式生成1∶1復(fù)合物，對(duì)活化MMPs具有專一的抑制作用。TIMPs對(duì)MMPs活性的抑制作用是MMPs活性的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。

有研究表明，牙周組織細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞均可表達(dá)分泌MMPs，MMPs在牙周組織的降解破壞過程中起著重要的作用。MMP-8屬于膠原酶，是與慢性牙周病有密切關(guān)系的基質(zhì)金屬蛋白酶［1］。本研究旨在探討慢性牙周炎患者和健康人群齦溝液中MMP-8和其抑制劑TIMP-1水平，了解慢性牙周炎患者齦溝液MMP-8以及TIMP-1水平與健康人群的差異和變化。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

30例臨床慢性中、重度牙周炎患者作為病例組。選擇標(biāo)準(zhǔn):無系統(tǒng)性疾病，近3個(gè)月未使用抗生素及免疫制劑，近3個(gè)月未進(jìn)行牙周藥物及手術(shù)治療。每例患者選取1顆牙周袋探診深度≥4 mm，且頸部無齲損和充填體的第1或第2磨牙作為觀察對(duì)象。

30例牙周健康者作為對(duì)照組。選擇標(biāo)準(zhǔn):無系統(tǒng)性疾病，近3個(gè)月未使用抗生素及免疫制劑，近3個(gè)月未進(jìn)行牙周藥物及手術(shù)治療。齦溝深度≤2 mm，齦溝探診不出血，無明顯牙齦退縮，牙頸部無齲壞和充填體。每例選取1顆第1或第2磨牙作為觀察對(duì)象。

1.2 材料與儀器

Whatman 3號(hào)濾紙購自英國 Whatman公司，Sorvall LengendRT型低溫離心機(jī)購自美國Thermo Fisher Scientific公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，人 MMP-8、TIMP-1 ELISA試劑盒購自美國Biosource公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

GCF采集及定量:將Whatman 3MM濾紙裁成10 mm×2 mm的紙條，隨機(jī)取3條放入有標(biāo)記Ep管中，編號(hào)、電子天平稱重，吹干患牙，隔濕;將預(yù)先稱重的濾紙條放入待檢牙的取液區(qū)(近中、頰面、遠(yuǎn)中，3位點(diǎn)/牙)，放置30 s，稱重，兩次稱重結(jié)果之差即為該牙GCF的重量。樣本置于-70°低溫冰箱中保存。2周內(nèi)在室溫下解凍樣本，每管加入200 μl Tris-HCl液(pH 7.5)，振蕩 1 h，低溫離心 10 min(4℃，離心半徑10 cm，10 000 r/min)，取上清液。樣品采用雙抗體夾心ABC-Elisa法進(jìn)行檢測(cè)，依照試劑盒說明進(jìn)行樣品檢測(cè)。最后通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中MMP-8以及TIMP-1的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)完成。采用兩樣本獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

數(shù)據(jù)顯示病例組GCF中MMP-8含量高于正常對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。TIMP-1兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MMP-8/TIMP-1比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病例組齦溝液重量高于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 病例組與對(duì)照組齦溝液MMP-8、TIMP-1濃度以及MMP-8/TIMP-1比值Tab.1 The expression of MMP-8，TIMP-1 and MMP-8/TIMP-1 ratio in GCF of 2 groups

3 討 論

牙周病是細(xì)菌感染性疾病，致病微生物在牙周病的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。牙周炎所致的組織破壞主要由宿主的炎癥介質(zhì)介導(dǎo)，這種反應(yīng)包括介導(dǎo)細(xì)胞活性和導(dǎo)致組織破壞的細(xì)胞因子顯著增多［2］。MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)的重要酶類，對(duì)牙周組織的破壞起關(guān)鍵作用。MMPs通過降解破壞牙周支持組織參與牙周組織附著喪失以及牙槽骨的吸收，在牙周病變過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，多種 MMPs在牙周炎癥過程中發(fā)揮作用。Rathnayake等［3］研究發(fā)現(xiàn)，重癥牙周炎患者唾液中MMP-8的濃度顯著高于正常人群。Marcaccini等［4］也認(rèn)為，慢性牙周炎患者齦溝液MMP-8水平顯著高于正常組。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者齦溝液MMP-8水平明顯高于正常對(duì)照組。說明牙周炎癥可調(diào)高M(jìn)MP-8的分泌水平，參與牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)MMP-8在牙周病的作用尤為重要，研究表明，臨床牙周治療可顯著降低MMP-8的水平，提示MMP-8可作為疾病現(xiàn)狀的判斷指標(biāo)之一，并且可能用于疾病預(yù)后的評(píng)估。MMP-8可能作為一項(xiàng)臨床指標(biāo)，用于牙周病診斷以及監(jiān)測(cè)。M?ntyl?等［5］由此提出椅旁 MMP-8 檢測(cè)方法。由于這種檢測(cè)方法可由牙醫(yī)獨(dú)立操作完成，而不需借助專門的儀器，頗具有實(shí)用性，故GCF中MMP-8的檢測(cè)可能成為診斷和監(jiān)測(cè)牙周病發(fā)展的實(shí)用工具。

本研究發(fā)現(xiàn)病例組TIMP-1水平高于正常對(duì)照組，但二組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。作為MMP-8的抑制劑，TIMP-1廣泛存在于體液和組織液中，其對(duì)MMP-8的抑制作用也是近年來牙周研究的一個(gè)熱點(diǎn)。一般認(rèn)為，MMPs和TIMPs間的平衡調(diào)節(jié)著細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。MMPS/TIMPS的失衡造成組織的吸收。有文獻(xiàn)［6］表明，TIMP-1在健康組織中保持較高水平，在早期炎癥TIMP-1水平較低。而另有文獻(xiàn)則有相反結(jié)論，炎癥過程中，宿主通過產(chǎn)生TIMP-1作為抗水解蛋白酶來對(duì)抗和調(diào)節(jié)MMPs對(duì)組織造成的破壞。所以在炎癥組織中，TIMP-1維持較高 水 平，以 對(duì) 抗 MMPs 對(duì) 組 織 的 破 壞［7-9］。Marcaccini等［10］則認(rèn)為慢性牙周炎患者與正常人群齦溝液中TIMP-1水平無差異，但兩組間MMP-8/TIMP-1比值有顯著差異，由此推論MMP-8的升高是導(dǎo)致MMP-8/TIMP-1失衡的原因。體外研究發(fā)現(xiàn)，牙齦卟啉單胞菌可以降解TIMP-1，使TIMP-1失去活性。牙齦卟啉單胞菌可能通過失活TIMP-1，使得炎癥位點(diǎn)MMPS水平增高，造成牙周組織的損傷［11］。由此可見，MMPs、TIMP-1 與牙周病發(fā)展有著更加復(fù)雜的關(guān)系。MMPs/TIMPs二者的平衡，對(duì)維持牙周健康具有重要作用。

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