楊建香，邱聲祥，佘志剛，林永成

( 1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650；2. 桂林師范高等?？茖W(xué)校，廣西 桂林 541001；3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275）

研究與開發(fā)

南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-3代謝產(chǎn)物研究

楊建香1,2，邱聲祥1，佘志剛3，林永成3

( 1.中國(guó)科學(xué)院華南植物園植物資源保護(hù)與可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650；2. 桂林師范高等?？茖W(xué)校，廣西 桂林 541001；3. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275）

研究南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-3的代謝產(chǎn)物。采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠色譜法等進(jìn)行分離純化，并通過(guò)理化常數(shù)測(cè)定和光譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。從南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-3的菌體中分離得到4個(gè)代謝產(chǎn)物，經(jīng)波譜解析，分別為2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxybenzoate.(1)，3'-dihydroxy-5,5'-dimethyldiphenyl ether(2)，7,8-二甲基苯并[g]蝶啶-2,4(1H,3H)-二酮(3)，5-o-methylbostrycoidin (4)。初步藥理活性顯示化合物1對(duì)人體肝癌細(xì)胞hepG2抑制的IC50值為25μg·mL-1。所有化合物均首次從南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-3中分離得到。

紅樹林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物

由于海洋環(huán)境的特殊性, 海洋微生物以其特有的代謝方式, 產(chǎn)生出結(jié)構(gòu)新穎、 具有多種生理活性的化合物, 成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[1-5]。 紅樹林是熱帶和亞熱帶沿海地區(qū)特有的植物群落 ,一般生長(zhǎng)在海岸及河口潮間帶泥地里 ,具有十分獨(dú)特的生理和生態(tài)[6]。紅樹林是海洋微生物的良好棲息地 ,大部分海洋微生物都可在紅樹林中找到, 但國(guó)內(nèi)外對(duì)紅樹林微生物特別是內(nèi)生真菌的代謝研究報(bào)道極少。本文對(duì)南海紅樹林內(nèi)生真菌ZH-3代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從菌體中分離得到4個(gè)化合物：2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxyben zoate.(1)，3,3'-dihydroxy-5,5'-dimethyldiphenyl ether (2)，7,8-二甲基苯并[g]蝶啶-2,4(1H,3H)-二酮(3)，5-o-methylbostrycoidin (4)，通過(guò)MS、NMR等波譜分析方法確定它們的結(jié)構(gòu)（圖1）。初步藥理活性顯示化合物1對(duì)人體肝癌細(xì)胞hepG2抑制的IC50值為25μg·mL-1。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

INOVA-500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀和INOVA-300NB核磁共振儀；VGZAB-HS雙聚焦質(zhì)譜儀，Thermo DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀，Thermo MAT95XP高分辨質(zhì)譜儀；X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀。

所用試劑均為化學(xué)純，溶劑經(jīng)重蒸后使用。柱層析硅膠為0.048～0.075mm硅膠，硅膠H， 薄層硅膠GF254。

1.2菌種培養(yǎng)

紅樹林內(nèi)生真菌ZH-3采自廣東省珠海市，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌(Phomopsis sp.)，保存于中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10g·L-1，蛋白胨2g·L-1，酵母膏1g·L-1，粗海鹽2g·L-1，pH7.0。650mL三角瓶?jī)?nèi)裝培養(yǎng)基280mL，1.25×105Pa 滅菌25 min后接種120L，在25℃靜置培養(yǎng)30d。分別收集發(fā)酵液和菌體。

圖1 化合物1～4的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structures of compounds 1～4

1.3提取與分離

120L發(fā)酵物過(guò)濾得菌體和發(fā)酵液，發(fā)酵液濃縮后用乙酸乙酯充分萃取，菌體用甲醇多次浸泡。提取濃縮物分別以體積比1∶2拌硅膠(0.048～0.075mm)進(jìn)行柱層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度加壓洗脫。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化。從菌體粗提物(約15g)分離得到化合物1(15mg)，2(10mg)，3(10mg)，4(12mg)。

1.4細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)

采用MTT法[7]測(cè)定了化合物1對(duì)人體肝癌細(xì)胞hepG2細(xì)胞毒的活性。

1.5化合物的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

化合物1：淡黃色針狀晶體。1H NMR(500 MHz,CD3OD)：6.96(d,1H,J=2.8)，6.66(d,1H,J=2.8)，6.22(s,1H)，3.71(s,CH3)，3.69(s,CH3)，2.30(s,CH3)。13C NMR (125MHz，CD3OD)：202.1(C)，168.0(C)，160.6(C)，160.0(C)，159.1(C)，158.8(C)，146.2(C)，130.0(C)，127.8(C)，112.7(C)，111.9(C)，109.8(CH)，109.0(CH)，104.4(CH)，56.7(CH3)，52.6(CH3)，21.1(CH3)。EIMS：366 [M+] for C17H15O7Cl。

化合物2：褐色固體，易溶于常用溶劑。1HNMR (300MHz，CDCl3) δ：7.36(OH,brs)，6.40(2H,d,1.5)，6.29(1H,t,1.5)，2.26(3H,s)。13CNMR (300MHz，CDCl3) δ：158.1(C)，156.6(C)，141.2(C)，112.4(CH)，111.5(CH)，103.7(CH)，21.8(CH3)。EIMS m/z [M+]：230，C14H14O3。

化合物3：黃色粉末，mp：298～300℃，1HNMR (DMSO-d6，500MHz)：δ：11.69(s,1H)，11.86(s,1H)，7.91(s,1H)，7.70(s,1H)，2.46(s,3H)，2.48(s,3H)；13CNMR(DMSO-d6,125MHz) δ：150.0(C)，160.6(C)，130.6(C)，138.4(C)，128.7(CH)，144.6(C)，138.9(C)，125.8(CH)，141.6 (C)，146.4 (C)，19.5 (CH3)，20.2 (CH3)。

化合物4： 紅色粉末狀固體，mp：209～210℃；EIMS：m/z 299；1HNMR (CDCl3，300 MHz) δ：9.42(1H,s)，2.77(3H,s)，7.57(1H,s)，3.99(3H,s)，3.93(3H,s)，6.78 (1H,s)，13.53(1H,s)。13C NMR (CDCl3,75MHz)：δ 188.2(C)，177.4(C)，164.4 (C)， 157.9(C)，155.2(C)，149.3(CH)，148.7(C)，138.2(C)，126.2(C)，118.0(CH)，116.1(C)，111.5(C)，107.9(CH)，57.6(CH3)，56.8(CH3)，25.3 (CH3)。

2 結(jié)果與討論

化合物1：淡黃色針狀晶體，在常用溶劑中都可溶。EIMS顯示分子離子峰為366，并有氯原子同位素峰，顯示化合物中含有1個(gè)氯原子，分子式為C17H15ClO7。1HNMR顯示化合物有3個(gè)苯環(huán)氫，2個(gè)甲氧基，1個(gè)甲基。13CNMR 和 DEPT除給出以上信息外還給出1個(gè)酮羰基，1個(gè)羧羰基，2個(gè)苯環(huán)。將化合物數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]對(duì)照后，得到化合物的結(jié)構(gòu)為2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxybenzoate。

化合物2：褐色固體，EIMS顯示化合物的分子量為230，結(jié)合核磁數(shù)據(jù)得到化合物的分子式為C14H14O3，13C NMR顯示有7個(gè)碳的信號(hào)，1個(gè)苯環(huán)和1個(gè)苯環(huán)上的甲基，所以分子內(nèi)存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)，1HNMR與碳譜得到的結(jié)論相同，同時(shí)顯示羥基信號(hào)。與文獻(xiàn)[9]對(duì)照后確定化合物的結(jié)構(gòu)為3,3'-Dihydroxy-5,5'-dimethyldiphenylether。

化合物3：EIMS顯示分子量為243，結(jié)合核磁數(shù)據(jù)，推斷出該化合物的分子式為：C12H10N4O2，13CNMR和DEPT譜顯示有12個(gè)碳，其中包括2個(gè)酰亞胺羰基(δ160.6×10-6，150.0×10-6)，6個(gè)芳香季碳(δ 146.4×10-6，144.6×10-6，141.6×10-6，138.9×10-6，138.4×10-6，130.6×10-6)，2個(gè)次甲基碳(δ128.7×10-6，125.8×10-6), 2個(gè)甲基碳(δ20.2×10-6，19.5×10-6)，1H NMR譜顯示2個(gè)活潑的酰亞胺質(zhì)子δ11.86 (1H，s)，δ11.69(1H，s)，2個(gè)芳香質(zhì)子δ7.91(1H，s)，7.70×10-6(1H，s)，2個(gè)甲基質(zhì)子δ2.48(3H，s)，δ2.46(3H，s)。通過(guò)這些信息，進(jìn)一步與文獻(xiàn)[10]對(duì)照，確定該化合物為7,8-二甲基苯并[g]蝶啶-2,4(1H,3H)-二酮。

化合物4：黃色粉末狀固體，1HNMR譜圖顯示有7個(gè)單峰，1個(gè)螯合的羥基峰(δ 13.53×10-6)，3個(gè)孤立的芳香質(zhì)子峰(δ9.42×10-6，7.57×10-6，6.78×10-6)，2個(gè)連氧的甲基峰(δ3.93×10-6，3.99×10-6)，1個(gè)甲基(δ2.77×10-6)。13CNMR和DEPT譜圖顯示有16個(gè)碳，其中3個(gè)CH3，3個(gè)CH，10個(gè)季碳。EIMS顯示分子離子峰m/z為299。結(jié)合上面的核磁譜圖，可以推出該化合物的分子式為C16H13NO5，不飽和度為11。根據(jù)所得核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]對(duì)照，確定該化合物為已知化合物5-o-methylbostrycOidin。

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Metabolites of Mangrove Endophytic Fungus ZH-3 from South China Sea

YANG Jian-xiang1,2, QIU Sheng-xiang1, SHE Zhi-gang3, LIN Yong-cheng3
(1. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization , South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, China; 2. Department of Chemistry and Engineering, Guilin Normal College, Guilin 541002, China; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

Secondary metabolites of mangrove endophytic fungus No. ZH-3 from South China sea were studied. The compounds were isolated by column chromatography and identified on the basic of physic-chemical constants and spectral analysis. Four metabolites were obtained and elucidated as 2-(3-chloro-2,6-dihydroxy-4-methylbenzoyl)-5-hydroxy-3-methoxybenzoate. (1),3,3’-dihydroxy-5,5’-dimethyldiphenylether（2）, 7,8-dimethylbenzo[g]pteridine-2,4(1H,3H)-dione (3), 5-o-methylbostrycoidin (4). In the preliminary bioassay, 1 show inhibittory activity on the hepG2 cell line with IC50values of 25μg/mL. The four metabolites were obtained from endophytic fungus No. ZH-3 for the frst time.

mangrove; endophytic fungus; metabolites

O 629

A

1671-9905(2014)02-0001-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373293)，國(guó)家863計(jì)劃和支撐計(jì)劃項(xiàng)目(201473948)，廣西教育廳科研項(xiàng)目（201204LX497）

楊建香（1979-），女，漢族，博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。電話：020-37082553，E-mail: 791011@126.com

2013-11-22