杜長亮 貢建偉

南京航空航天大學(xué)體育部（南京 210016）

廢用性肌萎縮主要指肢體在運(yùn)動(dòng)減退、制動(dòng)、失重等狀態(tài)下，骨骼肌所發(fā)生的生理、生化、形態(tài)學(xué)及功能的變化，臨床上許多疾?。ㄈ绨c瘓、肌肉拉傷）或治療措施（如骨骼固定等）常常伴有運(yùn)動(dòng)減退或要求制動(dòng)。目前，電刺激在臨床中應(yīng)用非常廣泛，關(guān)于電刺激治療肌肉萎縮的機(jī)制和效果雖然還不完全清楚，但其安全性和有效性在臨床實(shí)踐的許多領(lǐng)域得到證實(shí)，如肌電生物反饋改善藥物吸收、電刺激鎮(zhèn)痛、肌肉控制運(yùn)動(dòng)和姿勢、促進(jìn)慢性傷口愈合等[1-3]，相關(guān)研究也表明，電刺激可以興奮神經(jīng)肌肉組織，每個(gè)脈沖都有可能引起一次運(yùn)動(dòng)反應(yīng)[4，5]。本文利用大鼠廢用性肌萎縮模型，探討電刺激對(duì)腓腸肌和比目魚肌萎縮肌肉的恢復(fù)效果及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和電刺激方式

采用改良式尾部懸吊法建立大鼠廢用性肌萎縮模型[6]。32只雄性6周齡SD大鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SCXK滬2009-0002。單籠飼養(yǎng)，尾部懸吊，前肢著地，后肢懸空，身體長軸與水平面成30°角。動(dòng)物在籠內(nèi)自由活動(dòng)和進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)室溫度20～25℃。人工控制室內(nèi)照明，每天保證12小時(shí)光照，晝夜循環(huán)交替[7]。本實(shí)驗(yàn)在南京醫(yī)科大學(xué)完成。

大鼠分正常組、廢用性肌萎縮組、隔日電刺激組、每日電刺激組4組，每組8只。廢用性肌萎縮模型建立成功后，兩電刺激組每日1次或隔日1次電刺激大鼠腓腸肌和比目魚肌，刺激頻率30 Hz，波寬200 μs，可見被刺激部位肌肉明顯收縮，每次刺激30分鐘，持續(xù)30天。

1.2 mATPase組織化學(xué)染色方法

電刺激結(jié)束后，32只大鼠立即經(jīng)戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔麻醉后解剖，迅速取出右側(cè)后肢腓腸肌和比目魚肌，然后取中段約10 mm，投入4%多聚甲醛固定，常規(guī)方法制作石蠟組織切片。進(jìn)行mATPase組織化學(xué)染色法染色[8]，測量骨骼肌各型肌纖維（紅肌、中間肌及白?。M截面積。

1.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測肌球蛋白重鏈I、IIa、IIx、IIb 基因表達(dá)

大鼠腓腸肌和比目魚肌勻漿后，采用Trizol方法提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)real time-PCR，測定 I、IIa、IIx、IIb 的相對(duì)表達(dá)量，其引物（上海生工）序列如下：I：引物序列，上游：5’-GGAGC TCACCTACCAGACAGA-3’；下游：5’-CTCAGGGCT TCACAGGCATCC-3’，擴(kuò)增片段長度308，基因銀行序列NM_017240.1。IIa：引物序列，上游：5’-CCT CTTACTTCCCAGCTGCACCTTCT-3’； 下游：5’-CTC AGGGCTTCACAGGCATCC-3’，擴(kuò)增片段長度239，基因銀行序列NM_001135157.1。IIx：引物序列，上游 ：5’-ACGGTCGAAGTTGCATCCCTAAAG-3’；下游：5’-CACCTTCGGTCTTGGCTGTCAC-3’，擴(kuò)增片段長度263，基因銀行序列NM_001135158.1。IIb：引物序列，上游：5’-AGCCTGCCTCCTTCTTCATCTGG-3’； 下游：5’-CACGGTTGCTTTCACATAGGACTC-3’，擴(kuò)增片段長度229，基因銀行序列NM_019325.1。β-actin： 引物序列， 上游：5’-CACCCGCGAGTAC AACCTTC-3’； 下游：5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’，擴(kuò)增片段長度207，基因銀行序列 NM_031144.2。

反應(yīng)體系為 20 μl，包含 2 μl cDNA 模板（1 μg/μl），0.4 μl引物（10 nM），10 μl SYBR green I，7.2 μl超純水。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性10秒，93℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)在ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI Co，USA）上進(jìn)行，72℃～95℃緩慢升溫，產(chǎn)生相應(yīng)指標(biāo)的溶解曲線，重復(fù)檢測2次。以β-actin為內(nèi)參。

1.4 Western blot檢測MAPK相關(guān)激酶蛋白表達(dá)

肌肉組織勻漿后，提取蛋白，BCA法定量，分裝并保存于-80℃，備用。蛋白98℃變性5分鐘，進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，60V濃縮膠，120V分離膠，2.5～3小時(shí)。電泳后取下膠，按尺寸剪取合適大小的Whatmann濾紙及硝酸纖維素膜，采用半干式轉(zhuǎn)膜，恒壓20 V，時(shí)間為膜面積乘以系數(shù)1.6，轉(zhuǎn)移蛋白到硝酸纖維素膜。1%BSA，37℃封閉1小時(shí)。加入PBST稀釋至工作液濃度的 p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin 一抗 （南京凱基生物），37℃孵育1～2小時(shí)。再加入用PBST稀釋二抗至工作液濃度，37℃避光孵育1 h。反應(yīng)結(jié)束后棄二抗，用PBST清洗，采用Odyssey近紅外熒光掃描成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司產(chǎn)品）掃膜。

采用Motic Images plus 2.0彩色圖像分析系統(tǒng)對(duì)肌纖維組織化學(xué)和免疫組化學(xué)結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)。每例動(dòng)物隨機(jī)抽取3張接近肌腹中部的肌肉組織切片，每張切片在200倍光鏡下隨機(jī)觀測5個(gè)視野，根據(jù)mATPase染色強(qiáng)度確認(rèn)呈陰性的為Ⅰ型肌纖維，呈陽性的則為Ⅱ型肌纖維，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的不同類型肌纖維。計(jì)算每組動(dòng)物不同類型肌纖維數(shù)量，再求其在所有肌纖維中的比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦變換，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以 （均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，方差齊時(shí)，組間比較采用方差分析，方差不齊時(shí)用秩和檢驗(yàn)，以0.05作為顯著性差異界值。

2 結(jié)果

2.1 肌纖維比例

表1顯示，廢用性萎縮組大鼠腓腸肌I型肌纖維比例較正常組降低了29.94%，II型肌纖維比例增加了7.33%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在比目魚肌觀察到同樣的結(jié)果，廢用性萎縮組I型肌纖維比例較正常組降低了18.73%，同時(shí)II型肌纖維比例增加了52.02%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

只比較I型肌纖維，兩電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌I型肌纖維比例較廢用性萎縮組升高明顯。隔日電刺激組腓腸肌I型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組升高了13.35%，每日電刺激組升高了34.68%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隔日電刺激組比目魚肌I型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組升高了8.97%，每日電刺激組升高了19.00%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

只比較II型肌纖維，隔日電刺激組和每日電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌II型肌纖維比例較廢用萎縮組減少明顯。隔日電刺激組腓腸肌II型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組減少了0.97%，每日電刺激組較廢用性肌萎縮組減少了4.38%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）。隔日電刺激組比目魚肌II型肌纖維比例較廢用性肌萎縮組減少了13.32%，每日電刺激組較廢用性肌萎縮組減少了28.23%，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

每日電刺激組肌纖維比例改變效果大于隔日刺激組，I型和II型肌纖維比例與廢用性萎縮組比較均有顯著性差異（P<0.05）。

表1 各組大鼠腓腸肌和比目魚肌肌纖維數(shù)量比較

2.2 肌球蛋白重鏈 I、IIa、IIx、IIb基因表達(dá)

表2可見，廢用性肌萎縮組的腓腸肌I型MHC mRNA表達(dá)比正常組下降16%，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），廢用性肌萎縮組的腓腸肌 IIa、IIx、IIb型 MHC mRNA表達(dá)比正常組升高2%、6%和23%，其中IIb升高明顯，與正常組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

廢用性肌萎縮組比目魚肌I型MHC mRNA表達(dá)較正常組下降32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05），廢用性肌萎縮組比目魚肌IIa和IIx型MHC mRNA表達(dá)較正常組分別升高5%和33%，其中IIx型升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

每日電刺激組和隔日電刺激組大鼠腓腸肌和比目魚肌I型MHC mRNA表達(dá)較廢用性萎縮組明顯升高，有顯著性差異（P<0.05），且每日刺激組恢復(fù)較隔日刺激組明顯。每日電刺激組和隔日電刺激組大 鼠 腓 腸 肌 和 比 目 魚 肌 II 型 （IIa、IIx、IIb）MHC mRNA表達(dá)較廢用性萎縮組有升有降，變化不統(tǒng)一。

表2 各組大鼠腓腸肌和比目魚肌MHC mRNA表達(dá)比較

2.3 JNK/MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)

采用灰度掃描儀 （CE Pathspeed CR MP310）對(duì)腓腸肌和比目魚肌肌纖維蛋白表達(dá)（圖1）進(jìn)行灰度掃描。結(jié)果顯示，電刺激組腓腸肌和比目魚肌肌纖維MAPK相關(guān)激酶蛋白表達(dá)與廢用性肌萎縮組相比均有明顯變化。正常組腓腸肌p-JNK表達(dá)是廢用性肌萎縮組的 3.4倍，p-ERK1/2是 2.48倍，p-p38是2.75倍；隔日電刺激組腓腸肌肌纖維p-JNK表達(dá)是廢用性肌萎縮組的2.66倍，p-ERK1/2是1.91倍，pp38是2.37倍；每日電刺激組p-JNK表達(dá)是廢用性肌萎縮組的2.93倍，p-ERK1/2是3.57倍，p-p38是3.31倍。

正常組比目魚肌肌纖維p-JNK表達(dá)是廢用性肌萎縮組的3.17倍，p-ERK1/2是1.44倍，p-p38是1.7倍；隔日電刺激組比目魚肌肌纖維p-JNK表達(dá)是廢用性肌萎縮組的4.25倍，p-ERK1/2是2.34倍，p-p38是1.77倍；每日電刺激組比目魚肌肌纖維p-JNK表達(dá)是廢用性肌萎縮組的4.66倍，p-ERK1/2是3.07倍，p-p38是1.95倍。

圖1 各組大鼠腓腸肌和比目魚肌肌纖維MAPK相關(guān)激酶蛋白表達(dá)（n=8）

3 討論

在廢用性肌萎縮中，骨骼肌纖維由Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉(zhuǎn)化[9]。大鼠骨骼肌肌球蛋白重鏈（MHC）基因表達(dá)的路線為：Ⅰ→Ⅱa→Ⅱx→Ⅱ[10，11]。 本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了此過程。腓腸肌外側(cè)主要以快肌纖維為主，纖維構(gòu)成比例約為I型20%，IIa型20%，IIx型10%，IIb型最多，約50%。而與此對(duì)比，比目魚肌以慢肌纖維為主，未發(fā)現(xiàn)IIb型肌纖維[12]，I型約占70%，IIa型20%，IIx型10%。骨骼肌萎縮后，無論以白肌為主的腓腸肌還是以紅肌為主的比目魚肌，I型肌纖維基因表達(dá)減少，IIa、IIx、IIb型肌纖維基因表達(dá)增多，I型肌纖維向II型肌纖維轉(zhuǎn)變。本實(shí)驗(yàn)中，無論每日刺激組還是隔日刺激組，30天電刺激均能減少肌纖維類型的轉(zhuǎn)變幅度，I、IIx、IIb型的轉(zhuǎn)變幅度均減少，但I(xiàn)Ia型表達(dá)較萎縮組增加。兩組電刺激比較，每日刺激組較隔日刺激組效果更明顯。以紅肌為主的比目魚肌I型肌纖維基因表達(dá)下降更明顯，可能是比目魚肌紅肌比重大，萎縮對(duì)紅肌基因表達(dá)影響更大的結(jié)果。

文獻(xiàn)報(bào)道，激烈運(yùn)動(dòng)激活MAPK相關(guān)激酶通路[13-15]。 絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs）是一類主要的信號(hào)分子，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。目前，至少鑒定出了4種MAPK家族成員，分別為細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 （ERK1/2），c-Jun N端激酶（JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK），p38 及 ERK[16，17]。每種 MAPK被特異的 MAPK激酶（MAPKK，MEK）激活，后者又被 MAPKK 激酶（MAPKKK，MEKK）激活，MAPK信號(hào)通路正是通過這種保守的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活其下游轉(zhuǎn)錄因子，MAPK是該信號(hào)通路的樞紐[18]。在骨骼肌纖維中，激活的MAPK通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等，參與骨骼肌細(xì)胞增殖、生長、發(fā)育、分裂以及各種肌細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化等多種生理和生化反應(yīng)[19]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，廢用性肌萎縮的肌纖維細(xì)胞中磷酸化JNK、ERK1/2、p38蛋白表達(dá)明顯低于正常組。當(dāng)隔日電刺激兩種肌纖維后，磷酸化JNK、ERK1/2、p38蛋白上調(diào)，每日電刺激組磷酸化JNK、ERK1/2、p38蛋白上調(diào)更明顯。這與肌球蛋白重鏈（MHC）基因表達(dá)趨勢一致，比目魚肌纖維細(xì)胞蛋白表達(dá)較腓腸肌纖維表達(dá)更明顯。這提示，電刺激骨骼肌纖維產(chǎn)生類似于激烈運(yùn)動(dòng)的生物學(xué)效應(yīng)，分子調(diào)控機(jī)制也有相同之處，在Ⅱ型肌纖維向Ⅰ型肌纖維轉(zhuǎn)化的過程中，MAPK通路可能起重要作用。

4 總結(jié)

采用改良式大鼠尾部懸吊法成功建立廢用性肌萎縮模型，模擬了臨床肌肉萎縮狀態(tài)，Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型轉(zhuǎn)化趨勢明顯。長期低頻電刺激改善廢用性肌萎縮，II型肌纖維向I型轉(zhuǎn)化，這對(duì)肌萎縮康復(fù)有積極意義。

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