蘇利強(qiáng) 趙廣濤

1江西中醫(yī)藥大學(xué)體育教學(xué)部（南昌 330004） 2河南教育學(xué)院

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)是研究基因表達(dá)的重要手段［1，2］，在生命科學(xué)和運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。但實(shí)驗(yàn)操作中PCR尚有不足，如常規(guī)PCR在引物設(shè)計(jì)方面需要兩個(gè)引物的退火溫度比較接近，在實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增階段需要針對(duì)引物的退火溫度摸索實(shí)驗(yàn)條件，既浪費(fèi)耗材又浪費(fèi)時(shí)間。如遇多個(gè)目的基因則要逐一擴(kuò)增，擴(kuò)增效率比較低。

研究人員對(duì)常規(guī)PCR進(jìn)行了改良，在PCR擴(kuò)增中，將相連循環(huán)的退火溫度設(shè)定得越來越低，這種PCR技術(shù)稱為降落PCR（TD-PCR）［3，4］。 退火溫度逐漸降低，可以使不同退火溫度的引物與模板結(jié)合，進(jìn)而延伸-擴(kuò)增。此方法可以同時(shí)擴(kuò)增不同退火溫度的多個(gè)目的基因，減少摸索退火溫度的次數(shù)，提高了PCR的效率。本實(shí)驗(yàn)采用TD-PCR方法對(duì)與運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的幾個(gè)mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，探討TDPCR在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 取材

清潔級(jí)SD大鼠，8周齡， 證號(hào)：JZDW，NO：2011-0183，由江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。按照要求進(jìn)行飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。

1.2 方法

1.2.1 分離淋巴細(xì)胞

麻醉動(dòng)物后股動(dòng)脈取血5 ml，在抗凝管中保存，采用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞。取抗凝血5 ml與PBS緩沖液1∶1混勻后，加入10 ml淋巴細(xì)胞分離液之液面上，以2000轉(zhuǎn)/分離心15分鐘，收集界面上的細(xì)胞，放入含有10 ml PBS緩沖液的試管中，充分混勻后，以1500～2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清液，留沉淀，再加入10 ml PBS緩沖液，1500～2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，這一過程重復(fù)2次，所得沉淀即為淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2.2 提取RNA

提取RNA用到的玻璃儀器采用烘箱300攝氏度高溫烘烤3小時(shí)以上，去除RNA水解酶；EP管、塑料軟管及移液槍頭等通過浸泡于DEPC溶液中過夜。第2天高壓蒸汽滅菌，后烘干備用；在提取RNA過程中，按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)清潔實(shí)驗(yàn)室、操作臺(tái)，不受RNA水解酶污染。

收集的淋巴細(xì)胞適當(dāng)溶于PBS緩沖液，定量107個(gè)細(xì)胞倒入離心管中，8000g、4℃離心2分鐘，棄上清后加入l mlTransZol Up，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5分鐘。TransZol Up購自北京全式金生物科技有限公司。

加0.2 ml氯仿，劇烈振蕩30秒，室溫孵育3分鐘。10000g、4℃離心15分鐘。此時(shí)樣品分成3層，無色的水相（上層）、中間層和粉紅色有機(jī)相（下層）。RNA主要在水相中，轉(zhuǎn)移無色的水相于新的離心管中，每使用1 ml TransZol Up加入0.5 ml異丙醇，顛倒混勻，室溫孵育10分鐘。10000g、4℃離心10分鐘，去上清，在管側(cè)和管底形成膠狀沉淀。

加1 ml 75%乙醇（DEPC處理的水配制），劇烈渦旋 （每使用1 ml TransZol Up至少加75%乙醇1 ml）。7500g、4℃離心5分鐘。棄上清，室溫晾干沉淀。沉淀溶于50～100 μl RNA溶解液中。 55℃～60℃孵育10分鐘，保存樣品于-70℃?zhèn)溆谩?duì)總RNA進(jìn)行電泳，紫外分光光度計(jì)測試OD260/OD280值。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄過程

建立20 μl的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，將以下組分加入無核酸酶的微量離心管中：1μl oligo（dT）12～18（500 μg/ml）、500 ng總RNA、1 μl 10 mM dNTP混合物，加入滅菌蒸餾水至12 μl滅菌蒸餾水；混合物在65℃加熱5分鐘后，迅速置于冰上冷卻。短暫離心后，加入以下組分：4 μl 5×第一鏈合成緩沖液、2 μl 0.1M DTT、1 μl RNaseOUTTM核酸酶抑制劑（40單位/μl）；在離心管中輕輕將各種成分混合，并在37℃下孵育2分鐘；在室溫下加入1 μl（200單位）M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕地吹打混勻；37℃孵育50分鐘；70℃加熱15分鐘以終止反應(yīng)；4℃保存用于PCR擴(kuò)增。

1.2.4 PCR引物設(shè)計(jì)、合成與純化

根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的大鼠基因序列信息，運(yùn)用DNAstar進(jìn)行基因序列的同源性比較，擴(kuò)增的mRNA引物設(shè)計(jì)、合成和純化由生工生物工程 （上海）有限公司完成，合成后引物的采用ULTRAPAGE方法進(jìn)行純化。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小

1.2.5 PCR過程

取12份等量的cDNA溶液，分為兩個(gè)6份。第一個(gè)6份分別加入6對(duì)引物，均配成總體積為20 μl的反應(yīng)體系，用于常規(guī)PCR反應(yīng)。第二個(gè)6份同第一個(gè)6份，分別同量加入6對(duì)引物，配成總體積為20 μl的反應(yīng)體系。

每個(gè)終體積20μl的反應(yīng)體系包括：18μl PCRsupperMix、0.5 μl上游擴(kuò)增引物（10 μM）、0.5 μl下游擴(kuò)增引物（10 μM）、1 μl cDNA（來自于RT過程反應(yīng)產(chǎn)物cDNA）。

常規(guī)PCR循環(huán)條件：變性94℃加熱3min，進(jìn)行94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min；36個(gè)循環(huán)，75℃延伸7 min，然后4℃保存待電泳。

遞降PCR循環(huán)條件：變性94℃加熱3 min，擴(kuò)增（94℃ 30 s；55℃ 30 s；72℃ 1 min）2個(gè)循環(huán)，（94℃ 30 s；54℃ 30 s；72℃ 1 min）4個(gè)循環(huán)，（94℃ 30 s；53℃30 s；72℃ 1 min）10個(gè)循環(huán)，（94℃ 30 s；52℃ 30 s；72℃ 1 min）20個(gè)循環(huán)；75℃ 7 min，然后4℃保存待電泳。

RNaseOUTTM核酸酶抑制劑、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和PCRsupperMix等RT-PCR相關(guān)試劑購自invitrogen公司。

1.2.6 電泳、顯色與成像

第一個(gè)6份在一個(gè)膠上電泳，第二個(gè)6份在另外一個(gè)膠上電泳，每份取10 μl PCR產(chǎn)物在一個(gè)泳道上樣，采用1.5%瓊脂糖電泳20分鐘，EB染色，紫外線顯色成像。

2 結(jié)果

2.1 提取總RNA完整性

RNA完整性鑒定，采用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，圖1顯示RNA提取完整，采用紫外分光光度計(jì)定量OD260／OD280值為1.86，表明RNA純度較高。

2.2 6個(gè)不同目的基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖2為TD-PCR結(jié)果，只有Tbx21 mRNA成熟序列逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA未被擴(kuò)增出來，其它擴(kuò)增的產(chǎn)物均對(duì)應(yīng)相應(yīng)的Marker，與預(yù)期條帶的位置相同，并且條帶顯示較好。圖3顯示，常規(guī)PCR采用一個(gè)退火溫度擴(kuò)增，只有內(nèi)參被成功擴(kuò)增，其他目的基因均未擴(kuò)增成功。TD-PCR較常規(guī)PCR有較大優(yōu)勢。

3 討論

3.1 擴(kuò)增的基因功能概述

MHC-II是免疫呈遞過程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)所需要的部分，CD74是MHC-II的不變鏈［5］。 CD74通過與CD44、CXCR4和CXCR2形成復(fù)合體實(shí)現(xiàn)調(diào)控免疫細(xì)胞的功能［6，7］。

GATA蛋白家族屬于Ⅳ型鋅指蛋白，具有高度保守的相同DNA結(jié)合功能域，此結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)相似的Ⅳ型鋅指結(jié)構(gòu) （Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys），其梭基端的鋅指結(jié)構(gòu)對(duì)結(jié)合特異性DNA序列是必需的，而氨基端的鋅指結(jié)構(gòu)可與前者相互作用，增加結(jié)合的穩(wěn)定性與特異性。GATA蛋白家族成員較多，功能不盡相同，其中GATA-3蛋白在調(diào)控免疫中起到重要作用，也是免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。GATA-3與TCR的4個(gè)亞單位α、β、γ、δ的增強(qiáng)子發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)TCR基因表達(dá)，繼而誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，因此GATA-3被認(rèn)為是T細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)T細(xì)胞的發(fā)育和激活起重要作用［8］。

Tbx21基因也被稱為T-bet，是T-box轉(zhuǎn)錄因子家族成員中的重要成員。該基因編碼的T-bet蛋白是調(diào)節(jié)CD4+細(xì)胞分化的T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，使Th前體細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化，也是CD8+原始T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，T-bet與機(jī)體細(xì)胞免疫密切相關(guān)［9］。 本次研究中，Tbx21 mRNA未擴(kuò)增出來，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件分析，可能相比其他mRNA，Tbx21 mRNA表達(dá)豐度較小，經(jīng)過36個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后仍未顯示出來，也可能是引物的實(shí)際Tm值較低，在溫度梯度55℃～52℃的遞降過程中，引物與底物特異性結(jié)合不好造成的。但具體原因尚需探討。

Fas是細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的膜表面分子，在探討細(xì)胞凋亡過程中起重要作用。

泛素是一個(gè)由76個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的多肽，因其廣泛分布于各類細(xì)胞中而得名，被泛素標(biāo)記的蛋白質(zhì)將被特異性地識(shí)別并被迅速降解。細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解是一個(gè)被嚴(yán)密調(diào)控的復(fù)雜過程，此過程在涉及細(xì)胞基本進(jìn)程（如DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡等）、抗原呈遞、炎癥反應(yīng)等一系列通路中扮演重要角色［10］。Ube2c基因是編碼泛素鏈接酶E2，在泛素化過程中起重要作用。

3.2 TD-PCR技術(shù)

TD-PCR法可以同時(shí)擴(kuò)增多基因，快速了解其mRNA表達(dá)。在研究表達(dá)豐度、基因多態(tài)性分析、質(zhì)粒重組與構(gòu)建的檢驗(yàn)等方面均可以發(fā)揮作用。本研究同時(shí)擴(kuò)增了和運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的幾個(gè)基因，這一方法還可以應(yīng)用到其他更多的基因。

常規(guī)PCR一次只能擴(kuò)增一個(gè)目的基因，主要由于常規(guī)PCR擴(kuò)增時(shí)退火溫度要精確。退火溫度過低，一些堿基形成的局部雙鏈不容易解開成單鏈，難以繼續(xù)碰撞和正確配對(duì)，不易形成以目的基因?yàn)槟０宓碾p鏈，在復(fù)性過程中降低特異性。如退火溫度過高，則引物難以在復(fù)性過程中結(jié)合到模板上，難以有效擴(kuò)增目的基因。一般在Tm值允許的范圍內(nèi)，盡量選擇較高的溫度。較高的溫度可以增加引物與模板結(jié)合的特異性，但實(shí)際摸索中一般從低溫開始，先出現(xiàn)目的條帶，目的條帶出現(xiàn)后再通過提高溫度等方法去除非特異條帶。

降落PCR（touchdown PCR，TD-PCR）的基本原理是根據(jù)引物的Tm值，設(shè)置一系列從高至低的退火溫度，開始選擇的退火溫度高于估計(jì)的Tm值，隨著循環(huán)的進(jìn)行，退火溫度逐漸低至Tm值，從而確保第一個(gè)引物與模板雜交時(shí)間發(fā)生在最佳互補(bǔ)的反應(yīng)物之間，最終低于Tm值［11，12］。 由于TD-PCR能夠設(shè)置多個(gè)退火溫度，使同時(shí)檢測多種目的基因成為可能。TD-PCR設(shè)計(jì)多循環(huán)反應(yīng)程序，可以使相連的循環(huán)的退火溫度越來越低，從而達(dá)到最佳擴(kuò)增條件，很好地彌補(bǔ)普通PCR的不足，用于降低或避免由于變性溫度和退火溫度相距較遠(yuǎn)的一對(duì)引物、短序列引物、復(fù)雜的模板DNA、Mg2＋濃度不適當(dāng)?shù)纫鸬募訇栃詳U(kuò)增［13，14］。

TD-PCR在分析、克隆基因上有較大的優(yōu)勢。對(duì)于采用常規(guī)PCR需要反復(fù)尋找退火溫度的目的基因的擴(kuò)增效果和效率更好，較快、較準(zhǔn)地獲得目的基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，用于比較分析、克隆等研究。TD-PCR的退火溫度設(shè)定是一個(gè)范圍，從高于Tm 5℃左右開始到低于Tm 10℃左右，溫度跨度較大。在溫度設(shè)置中，每一個(gè)溫度設(shè)置2個(gè)循環(huán)周期。為了更好擴(kuò)增出目的基因，較低溫度設(shè)置循環(huán)3～5個(gè)周期，高溫一般設(shè)置1～2個(gè)循環(huán)周期。高溫設(shè)置循環(huán)次數(shù)少是由于較高的退火溫度雖然增加了引物和模板結(jié)合特異性，但也有結(jié)合不上的風(fēng)險(xiǎn)，因此如在較高溫度未結(jié)合，在溫度降低的一個(gè)循環(huán)結(jié)合的幾率就增大，由于退火溫度在遞降，因此到一定溫度后就出現(xiàn)引物與模板特異的結(jié)合，溫度較低可以保證每個(gè)模板鏈均可以有效形成雙鏈，保證擴(kuò)增產(chǎn)量。由于PCR過程中的前幾個(gè)循環(huán)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的純度非常重要，因此前幾個(gè)循環(huán)設(shè)定較高的退火溫度會(huì)增加引物與模板結(jié)合的特異性，阻止非特異性產(chǎn)物形成［15，16］。

本研究使用TD-PCR方法擴(kuò)增了多個(gè)目的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA。6個(gè)引物的CG含量范圍在40.90%～54.50%，退火溫度變化范圍不大，采用遞降溫度為55°C降落到52°C，結(jié)果顯示，除了Tbx21 cDNA未擴(kuò)增出來外，其他均得以特異性擴(kuò)增。而常規(guī)PCR在一個(gè)溫度下只能特異性擴(kuò)增內(nèi)參。

4 總結(jié)

TD-PCR方有效擴(kuò)增mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA，不同cDNA引物可能出現(xiàn)不同Tm值，可通過設(shè)置遞降的退火溫度，一次擴(kuò)增多個(gè)cDNA，并具有較強(qiáng)特異性。雖然個(gè)別目的基因或cDNA由于引物設(shè)計(jì)、Tm值等原因不能同時(shí)成功擴(kuò)增，但總體看多數(shù)目的基因或cDNA能夠同時(shí)成功擴(kuò)增。不僅提高了擴(kuò)增成功率，而且提高了PCR的效率。在運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)領(lǐng)域的基因和mRNA研究中采用TD-PCR方法可以提高效率。

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