陳祥和 李世昌 孫朋 馬濤 楊念恩

1“青少年健康評價與運(yùn)動干預(yù)”教育部重點實驗室，華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（上海 200241） 2齊魯師范學(xué)院體育學(xué)院

成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）是重要的骨形成細(xì)胞，主要由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化產(chǎn)生，對骨生長發(fā)育、骨代謝平衡和增加骨密度 （bone mineral density，BMD）等有關(guān)鍵作用［1］。 BMSCs經(jīng)過一系列分化后成為OB，OB分化是骨生長發(fā)育和骨形成的前提。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控BMSCs向OB分化及OB成骨能力（亦稱礦化能力）的因素很多，如雌激素、細(xì)胞因子表達(dá)等［2］。而力學(xué)刺激在調(diào)節(jié)OB分化及其成骨能力上也有重要作用。但目前有關(guān)運(yùn)動訓(xùn)練對骨BMSCs、OB分化及其成骨能力的作用在停止訓(xùn)練后是否存在一直有爭議。本研究中，小鼠從5周齡開始訓(xùn)練到13周齡結(jié)束，處于生長發(fā)育期（簡稱生長期）［3］，以觀察此時運(yùn)動訓(xùn)練對骨形成和骨量積累的作用。本研究對生長期小鼠進(jìn)行8周下坡跑訓(xùn)練［4］，以去卵巢安靜狀態(tài)下正常喂養(yǎng)6周建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型［5］。利用全骨髓貼壁篩選法對BMSCs進(jìn)行原代培養(yǎng)并誘導(dǎo)其向OB分化［6］。 檢測培養(yǎng)皿中的細(xì)胞數(shù)量、BMSCs數(shù)量、OB礦化能力和BMD，分別從骨細(xì)胞和骨量兩個方面驗證以下兩個假設(shè)：（1）下坡跑訓(xùn)練對小鼠骨形成有促進(jìn)作用；（2）生長期下坡跑訓(xùn)練對小鼠骨影響在去卵巢安靜狀態(tài)喂養(yǎng)一段時間后仍然存在。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級4周齡C57BL/6雌性小鼠40只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016，體重（15.08±1.89）g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組：安靜組（C組）、運(yùn)動組（D組）、安靜去卵巢組（C+OVX組）、運(yùn)動去卵巢組（D+OVX組）和安靜假手術(shù)組（C+SHAM組），每組8只。動物訓(xùn)練和實驗指標(biāo)檢測均在華東師范大學(xué) “青少年健康評價與運(yùn)動干預(yù)”教育部重點實驗室完成。

1.2 運(yùn)動方案

C組、C+OVX組和C+SHAM組在籠中正常喂養(yǎng)，不進(jìn)行任何訓(xùn)練。D組和D+OVX組小鼠進(jìn)行下坡跑訓(xùn)練，方案：跑臺速度0.8 km/h，坡度-9°，每次訓(xùn)練40 min，每周訓(xùn)練5次，共訓(xùn)練8周。

1.3 去卵巢手術(shù)

第8周最后一次訓(xùn)練結(jié)束24 h后，C+OVX組和D+OVX組行去卵巢手術(shù)，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.1 g/kg）麻醉小鼠，剪除脊柱兩側(cè)長毛，分別在兩側(cè)切開1 cm切口，去除卵巢，利用可吸收羊腸線進(jìn)行縫合，傷口涂抹紅霉素軟膏。C+SHAM組行假手術(shù)。

1.4 取材

最后一次訓(xùn)練結(jié)束24 h后，C組和D組小鼠斷頸椎處死，75%酒精滅菌，于無菌操作臺取股骨和脛骨（去除軟組織）以備檢測細(xì)胞原代培養(yǎng)后BMSCs增殖和OB成骨能力；取小鼠前肢骨（保留軟組織）于75%酒精中保存，以備測BMD。C+OVX組、D+OVX組和C+SHAM組小鼠去卵巢喂養(yǎng)6周后，斷頸椎處死，取材步驟同上。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 BMSCs原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)OB分化

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：GIBICO培養(yǎng)基一瓶（500 ml裝），按10%小牛血清和100倍雙抗的比例進(jìn)行培養(yǎng)基配置，配好后放于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液：基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入100倍β-甘油磷酸鈉和1000倍維生素C，即配好OB誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液。

最后一次訓(xùn)練結(jié)束24 h后，剪除已取C組和D組小鼠股骨和脛骨兩側(cè)關(guān)節(jié)，暴露骨髓腔。用20 ml注射器吸取10 ml α-MEM培養(yǎng)基后配1 ml注射器針頭沖洗骨髓腔，將骨髓收集在50 ml離心管中，反復(fù)搖動將骨髓制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)后接種于6孔板（分A、B兩組）進(jìn)行BMSCs原代培養(yǎng)，培養(yǎng)后第3天更換培養(yǎng)液，第5天時A組進(jìn)行結(jié)晶紫染色和BMSCs的ALP染色測細(xì)胞數(shù)量。B組BMSCs第7天進(jìn)行OB誘導(dǎo)分化，每隔2～3天換液，共誘導(dǎo)14天，對誘導(dǎo)完的OB進(jìn)行Von Kossa染色。利用Blindness法統(tǒng)計細(xì)胞總數(shù)和BMSCs數(shù)量，利用Image J軟件統(tǒng)計礦化結(jié)節(jié)面積。

去卵巢正常喂養(yǎng)6周后，C+OVX組、D+OVX組和C+SHAM組進(jìn)行BMSCs原代培養(yǎng)并誘導(dǎo)其向OB分化，步驟同C組和D組。

1.5.2 小鼠前肢骨BMD檢測

取保存的小鼠前肢骨，利用Hologic Discovery A骨密度儀掃描小鼠前肢橈骨近端，測試BMD。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS17.0分析數(shù)據(jù)，利用方差分析的LSD分析組間顯著性差異。各組參數(shù)由均值和標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P<0.05為差異的顯著性標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異的非常顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞總數(shù)、BMSCs和OB礦化能力

表1顯示，與C組相比，D組培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)量無顯著性差異（P>0.05）。D+OVX組培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)量顯著多于C+OVX組（P<0.01）；與C+SHAM組相比，C+OVX組培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)量顯著下降 （P<0.01）；與C+SHAM組相比，D+OVX組培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)量亦顯著下降（P<0.01）。

表1 各組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞總數(shù)比較

表2顯示，與C組相比，D組BMSCs數(shù)量顯著增加（P<0.05）。 與C+OVX組相比，D+OVX組BMSCs數(shù)量顯著增加（P<0.05）；與C+SHAM組相比，D+OVX組（P<0.01）和C+OVX組（P<0.01）BMSCs數(shù)量均顯著下降。

表2 各組小鼠BMSCs數(shù)量比較

表3顯示，D組礦化結(jié)節(jié)面積顯著大于C組 （P<0.01）；D+OVX組礦化結(jié)節(jié)面積顯著大于C+OVX組（P<0.01）；與C+SHAM組相比較，C+OVX組（P<0.01）和D+OVX組 （P<0.05）礦化結(jié)節(jié)面積均顯著下降。

表3 各組小鼠礦化結(jié)節(jié)面積Von Kossa染色結(jié)果比較

2.2 前肢骨BMD

表4顯示，與C組相比，D組BMD值明顯升高（P<0.05）；與C+OVX組相比，D+OVX組BMD值顯著升高（P<0.05）； 與C+SHAM組相比，C+OVX組BMD值顯著下降 （P<0.05）； 與C+SHAM組相比，D+OVX組BMD值下降，但無顯著性差異（P>0.05）。

表4 各組小鼠前肢骨BMD值比較

3 討論

3.1 生長期下坡跑對去卵巢小鼠BMSCs的影響

BMSCs是位于骨髓腔內(nèi)的具有多向分化潛能的結(jié)締組織前體細(xì)胞，因其取材方便，易于體外培養(yǎng)，成為骨組織工程研究的理想種子細(xì)胞［7］。不同誘導(dǎo)條件下，BMSCs可分化為OB、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等［8］。BMSCs增殖分化與力學(xué)刺激存在密切關(guān)系。Huntsman等［9］研究證實，8周跳躍訓(xùn)練促進(jìn)小鼠BMSCs增殖并使其數(shù)量增多。 Menuki等［10］研究顯示，4天攀爬訓(xùn)練后小鼠骨髓腔中CFU-f（即BMSCs）數(shù)量變化不明顯。本研究中，8周訓(xùn)練結(jié)束后，堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示BMSCs數(shù)量顯著增多，這與Menuki等的研究不一致。其原因可能與運(yùn)動持續(xù)時間長短有關(guān)。與4天相比，8周訓(xùn)練時間對小鼠BMSCs增殖形成有效力學(xué)刺激。還可能與不同運(yùn)動方式對骨產(chǎn)生的力學(xué)刺激有關(guān)。下坡跑訓(xùn)練作用于骨的力學(xué)載荷較大，使胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）1/2和蛋白激酶B（AKT）磷酸化，進(jìn)而調(diào)控C-fos基因和蛋白表達(dá)，促進(jìn)BMSCs增殖［11］。而有研究也發(fā)現(xiàn)，力學(xué)刺激也通過IGF-1和上皮生長因子影響促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路來促進(jìn)小鼠BMSCs增殖［12］。

人體研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動員停訓(xùn)或退役后，運(yùn)動訓(xùn)練對骨產(chǎn)生的作用降低或完全消失［13］。動物研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動訓(xùn)練對骨產(chǎn)生的作用在停止訓(xùn)練后消失［14-15］。這提示停止訓(xùn)練后早期運(yùn)動對骨產(chǎn)生的作用逐漸消失。而有研究卻證實，運(yùn)動訓(xùn)練對骨產(chǎn)生的影響在停止訓(xùn)練后仍然存在［16，17］。 Warden等［18］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)利用軸向壓力加載裝置對雌性大鼠骨施加7周載荷后，其作用在停訓(xùn)96周內(nèi)仍然存在。這表明運(yùn)動訓(xùn)練對骨產(chǎn)生的作用在停止訓(xùn)練后仍然存在并持續(xù)較長一段時間。本研究中，去卵巢靜養(yǎng)6周后小鼠BMSCs數(shù)量仍較多，說明生長期下坡跑訓(xùn)練對小鼠BMSCs增殖所產(chǎn)生的影響在去卵巢靜養(yǎng)6周后仍然存在。但其分子生物學(xué)機(jī)制仍有待研究。

3.2 生長期下坡跑對去卵巢小鼠OB成骨能力的影響

OB主要由BMSCs分化產(chǎn)生，BMSCs數(shù)量增加時，由其分化產(chǎn)生的OB數(shù)量也增多，有助于提高OB成骨能力［19］。 運(yùn)動訓(xùn)練在調(diào)控BMSCs向OB分化及OB成骨能力過程中具有重要作用。Menuki等［8］和Mori等［20］在研究4周攀爬訓(xùn)練對雄性小鼠OB影響時，均發(fā)現(xiàn)分化產(chǎn)生的OB數(shù)量增多且成骨能力增強(qiáng)。本研究中，8周訓(xùn)練結(jié)束后D組礦化結(jié)節(jié)面積明顯增大，表明下坡跑訓(xùn)練顯著提高OB的成骨能力，與前人研究結(jié)果一致。這與BMSCs數(shù)量增多和下坡跑訓(xùn)練時地面反作用力對小鼠骨組織產(chǎn)生的有效刺激有關(guān)。力學(xué)刺激通過PPARγ2促進(jìn)Runx2表達(dá)或降低Runx2結(jié)合來提高游離Runx2含量，促進(jìn)OB分化及其成骨能力［21］，還通過Ca2+信號途徑、環(huán)氧酶-前列腺素E2途徑或者蛋白激酶A/蛋白激酶C（PKA/PKC）途徑等調(diào)控OB分化并提高其成骨能力［22］。

研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)去卵巢小鼠OB分化及成熟的相關(guān)基因表達(dá)［23］。那么生長期下坡跑對小鼠OB礦化能力所造成的影響在去卵巢后是否仍然存在呢？本研究發(fā)現(xiàn)，去卵巢6周后小鼠OB礦化能力仍維持在較高水平，說明生長期下坡跑對OB礦化能力所造成的影響在去卵巢靜養(yǎng)一段時間后仍然存在。這與Goulet等［24］的研究一致，他們研究發(fā)現(xiàn)，早期訓(xùn)練仍可促進(jìn)去卵巢小鼠TGF-β和Runx2基因表達(dá)進(jìn)而調(diào)控OB分化及其成骨能力。這可能與BMSCs數(shù)量仍較高有關(guān)，當(dāng)BMSCs數(shù)量較多時分化產(chǎn)生的OB也較多，OB成骨能力仍維持在較高水平［19］。本研究中，C+OVX組和D+OVX組OB成骨能力均顯著下降。一方面說明本研究去卵巢造模成功，另一方面說明去卵巢后雌激素降低顯著降低OB成骨能力。

3.3 生長期下坡跑對去卵巢小鼠BMD的影響

生長期是小鼠骨量增加的敏感期，適宜運(yùn)動訓(xùn)練對于增加小鼠骨量具有重要作用。Bourrin等［25］對生長期小鼠進(jìn)行11周跑臺訓(xùn)練后發(fā)現(xiàn)，下肢脛骨BMD顯著增加。Rowas等［26］研究發(fā)現(xiàn)，8周游泳訓(xùn)練使雌性C57BL/6小鼠腰椎骨密度顯著增加。本研究中，8周下坡跑訓(xùn)練結(jié)束后小鼠BMD顯著增加，說明下坡跑訓(xùn)練加快生長期小鼠骨形成，增加其橈骨BMD，與前人研究一致。這與小鼠OB成骨能力較高存在關(guān)系。 Caruso等［27］研究發(fā)現(xiàn)，OB成骨能力較高可加快骨形成使得BMD增加。

雌激素在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，小鼠去卵巢后雌激素濃度下降易造成骨量下降［23］。本研究中，去卵巢后小鼠前肢骨BMD均顯著下降，說明去卵巢后雌激素濃度下降可加速骨吸收，使小鼠前肢骨BMD下降，與Hao等［28］的研究結(jié)果一致。本研究中，去卵巢后小鼠BMD仍維持在較高水平，說明下坡跑對小鼠前肢骨BMD產(chǎn)生的影響在去卵巢停訓(xùn)后仍然存在。這可能與去卵巢小鼠BMSCs數(shù)量仍較多，OB成骨能力仍然較強(qiáng)有關(guān)。Umemura等［29］的研究結(jié)果與之相似，他們發(fā)現(xiàn)8周跳躍訓(xùn)練對脛骨BMD所造成的影響在24周后還仍然存在。Honda等［30］在其研究中也取得相似結(jié)果。

4 總結(jié)

下坡跑訓(xùn)練通過促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和提高成骨細(xì)胞成骨能力，加快骨形成，增加骨量。生長期下坡跑對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、成骨細(xì)胞成骨能力和骨密度所造成的影響在去卵巢后仍然存在。

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