李丹,郭小梅

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030)

諾考達(dá)唑抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制*

李丹,郭小梅

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科,武漢 430030)

目的 研究諾考達(dá)唑抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞(rVSMCs)的作用及機(jī)制。方法將rVSMCs分為A、B、C、D 4組,A組常規(guī)培養(yǎng),B組無血清培養(yǎng)24 h,C組無血清培養(yǎng)48 h后常規(guī)培養(yǎng)18 h,D組先后加入胸腺嘧啶核苷(工作濃度為0.05 g·mL-1)作用12 h后再加入諾考達(dá)唑(工作濃度為0.05 g·mL-1)繼續(xù)維持12 h。分別進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測,觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化,檢測糖代謝、氨基酸代謝與ATP以及NAD/NADH的變化以及線粒體融合蛋白2(Mfn-2)的表達(dá)。結(jié)果流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示B、C、D組細(xì)胞分別阻滯于G0/G1期,S期及G2/M期。電子顯微鏡檢測顯示D組線粒體的數(shù)量減少,體積縮小。D組與A組及C組相比,糖代謝、氨基酸代謝均顯著降低,ATP的產(chǎn)生明顯減少, NADH的生成顯著增加(P＜0.05)。Western Blot示G2/M期細(xì)胞阻滯與諾考達(dá)唑均可導(dǎo)致Mfn-2表達(dá)增高(P＜0.05)。結(jié)論諾考達(dá)唑可明顯降低rVSMCs能量代謝,阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài),可能與Mfn-2抗動脈粥樣硬化的作用有關(guān)。

諾考達(dá)唑;增殖,血管平滑肌細(xì)胞;大鼠;代謝,能量;線粒體融合蛋白-2;動脈粥樣硬化

經(jīng)皮冠狀動脈內(nèi)介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)術(shù)后再狹窄嚴(yán)重影響冠心病患者的預(yù)后,血管壁的損傷、炎癥以及血管平滑肌的增殖是造成血管再狹窄的主要因素,其中血管平滑肌的增殖是關(guān)鍵因素,因此阻止血管平滑肌的異常增殖,預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄,對改善患者預(yù)后具有重要的意義。筆者在本研究中首次發(fā)現(xiàn)諾考達(dá)唑可有效降低大鼠血管平滑肌細(xì)胞(rat vascular smooth muscle cells,rVSMCs)能量代謝,阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài),可為探索調(diào)控rVSMCs的異常增殖與分化提供新的思路和策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 Wistar大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞(rVSMCs),由美國國立衛(wèi)生研究院提供。

1.2 主要試劑 諾考達(dá)唑、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、RNase A(美國Sigma公司,批號:M1404, P4170,R6513);糖氧化水平定量試劑盒(美國,BioAssay Systems,批號:DIGL-100)、L-氨基酸定量檢測試劑盒(美國,BioVision,批號:K639-100)、ATP比色測定試劑盒(美國,BioVision,批號:K354-100)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD/NADH)檢測試劑盒(美國,BioAssay System,批號:E2ND-100、ECNP-100);兔抗線粒體融合蛋白2抗體(美國,abcam,批號ab50483)。

1.3 主要儀器 YT-875型超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠);Heal force二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(香港力康公司);Millipore超純水制備機(jī)(美國Millipore公司);低速/低溫超高速離心機(jī)(美國Sigma公司); FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);超薄切片機(jī)(德國LEICA ULTRACUT UCT);透射電鏡(荷蘭FEI Tecnai G212型);ELX-800酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司);電泳轉(zhuǎn)膜設(shè)備(美國Bio-Rad公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 A組:Wistar大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)選擇3～5代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞,采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng),細(xì)胞生長約50%豐度時進(jìn)行以下處理。B組為換DMEM高糖培養(yǎng)基(不含血清)同步化培養(yǎng)24 h;C組為DMEM高糖培養(yǎng)基(不含血清)同步化培養(yǎng)48 h,接著常規(guī)培養(yǎng)18 h;D組為先加入胸腺嘧啶核苷(工作濃度為0.05 g·mL-1)作用12 h后再加入諾考達(dá)唑(工作濃度為0.05 mg·mL-1)繼續(xù)維持12 h。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 收集細(xì)胞,0.25%胰酶消化,用10 mL培養(yǎng)基重懸;4℃,1 000 r·min-1離心8 min, 75%乙醇預(yù)冷,-20℃過夜;次日轉(zhuǎn)入流式管中,每管加入PI(工作濃度0.5 mg·mL-1)50 mL和RNase A (工作濃度100 mg·mL-1)10 mL,37℃,避光水浴30 min;室溫避光放置30 min;FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測并分析[1]。

1.6 常規(guī)透射電子顯微鏡成像 收集處理后的細(xì)胞,沿管壁緩慢加入2.5%戊二醛緩沖固定液,2.5%戊二醛緩沖固定液固定2 h,0.1 mmol·L-1磷酸緩沖液清洗2× 20 min,1%鋨酸后固定30～120 min,0.1 mmol·L-1磷酸緩沖液清洗,按50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇丙酮、90%丙酮、100%丙酮(2次)各5 min梯度脫水,丙酮與環(huán)氧樹脂1∶1混合半浸透2 h,純環(huán)氧樹脂包埋劑浸透2 h,包埋,聚合(80℃恒溫箱內(nèi))10 h,修塊。超薄切片染色:醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色各10 min;透射電鏡觀察、攝像。

1.7 糖氧化水平的定量檢測 按照QuantiChromTM糖氧化水平定量試劑盒(BioAssay Systems)說明書依次完成后,檢測A630 nm讀數(shù)。

1.8 L-氨基酸水平的定量檢測 按照BioVison L-氨基酸定量檢測試劑盒說明書依次完成后;檢測A570 nm。

1.9 ATP水平的比色測定 按照BioVison ATP Colorimetric檢測試劑盒說明書依次完成后;檢測A570 nm。

1.10 NAD/NADH水平的定量檢測 按照BioAssay EnzyChromTMNAD/NADH檢測試劑盒說明書依次完成后;檢測A570 nm[2]。

1.11 免疫印跡分析 收集細(xì)胞,每皿100 mm,加入RIPA裂解液100 mL,冰上裂解30 min;4℃, 12 000 r·min-1離心15 min,收集上清液,根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測待測蛋白樣品的A490 nm,計(jì)算待測蛋白樣品濃度;準(zhǔn)備蛋白樣品100 mg,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳;230 mA下轉(zhuǎn)印約2.5 h;室溫下5·TBS-脫脂牛奶振蕩封閉1 h;加入用封閉液稀釋的一抗,4℃孵育過夜;次日加入用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗,室溫振動孵育2 h;加入顯色液,避光孵育1 min;暗室曝光,顯影定影,膠片晾干后,經(jīng)掃描儀掃描,Adobe Photoshop軟件轉(zhuǎn)換格式后,Image J圖形軟件計(jì)算灰度值,進(jìn)行半定量分析。具體步驟參見已經(jīng)發(fā)表的文章[3]。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 19.0版統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間差異采用雙尾t檢驗(yàn),P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 諾考達(dá)唑可阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài) 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,A組大鼠血管平滑肌細(xì)胞G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞分布比例平均值依次為:51.36%, 39.53%和9.12%;B組采用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)24 h,平均約80.10%細(xì)胞停滯于G0/G1期; C組采用無血清DMEM高糖培養(yǎng)基同步化培養(yǎng)48 h,接著換DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)18 h,(58.88±4.72)%的rVSMCs停滯于S期;D組直接加入胸腺嘧啶核苷作用12 h將細(xì)胞同步化后,再加入諾考達(dá)唑繼續(xù)作用12 h后,平均75.07%的rVSMCs被阻滯于G2/M期(n=6)。見圖1。

2.2 電子顯微鏡結(jié)果顯示諾考達(dá)唑處理rVSMCs后超微結(jié)構(gòu)的改變 電子顯微鏡觀察顯示,C組與A組和B組比較,線粒體數(shù)量基本不變,但是明顯腫脹甚至透亮;但是,D組諾考達(dá)唑處理后,其線粒體的數(shù)量明顯減少,體積也顯著縮小,還出現(xiàn)了大量的自噬體。見圖2。

2.3 諾考達(dá)唑可導(dǎo)致rVSMCs能量代謝降低 A組與C組、B組與D組的rVSMCs糖代謝、氨基酸代謝、ATP的產(chǎn)生以及NAD/NADH的代謝水平均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但是,D組與A組和C組比較,rVSMCs糖代謝、氨基酸代謝、ATP的產(chǎn)生均明顯降低,NADH產(chǎn)生顯著增高(P＜0.05或P＜0.01,n=12)。見圖3。

2.4 諾考達(dá)唑可上調(diào)Mfn-2的表達(dá) 免疫印跡半定量分析的結(jié)果表明,A、B、C、D組rVSMCs中Mfn-2蛋白條帶與內(nèi)參Tubulin的相對灰度值分別為(0.331± 0.055),(1.057±0.424),(0.266±0.078),(1.067± 0.425)(n=9)(P＜0.05),即增殖期較未增殖期相比, Mfn-2的表達(dá)降低,諾考達(dá)唑處理后Mfn-2的表達(dá)較增殖期增高。見圖4。

A.A組;B.B組;C.C組;D.D組圖1 4組細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果(n=6)A.group A;B.group B;C.group C;D.group DFig.1 Results of cell cycle distribution in four groups by flow cytometry analysis(n=6)

A.A組;B.B組;C.C組;D.D組(粗箭頭示線粒體,細(xì)箭頭示自噬體)圖2 4組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電子顯微鏡結(jié)果A.group A;B.group B;C.group C;D.group D(coarse arrows show mitochondria,fine arrows show autophagosome)Fig.2 Ultrastucture changes of four groups of cells by transmission electron microscopy

A.糖代謝的水平;B.氨基酸代謝水平;C.ATP的產(chǎn)生;D.NAD水平;1.A組;2.B組;3.C組;4.D組;與A組比較,*1P＜0.01;與C組比較,*2P＜0.05圖3 諾考達(dá)唑處理后rVSMCs能量代謝的變化(n=12)A.metabolic levels of glucose;B.metabolic levels of L-amino acid;C.ATP production;D.NAD level;1.group A;2.group B;3.group C;4.group D;compared with group A,*1P＜0.01;compared with group C,*2P＜0.05Fig.3 Changes of energy metabolism of rVSMCs after nocodazole treatment(n=12)

A.電泳圖;B.柱形圖;1.A組;2.B組;3.C組;4.D組;與A組比較,*1P＜0.05;與C組比較,*2P＜0.05圖4 諾考達(dá)唑處理后Mfn-2表達(dá)的變化(n=12)A.electrophotogram;B.histogram;1.group A;2.group B;3. group C;4.group D;compared with group A,*1P＜0.05;compared with group C,*2P＜0.05Fig.4 Changes of Mfn-2 expression after nocodazole treatment(n=12)

3 討論

血管平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制一直是動脈粥樣硬化以及PCI術(shù)后再狹窄研究的熱點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為炎癥與免疫、血流動力學(xué)的不穩(wěn)定等在血管平滑肌細(xì)胞的增殖中扮演著重要的角色。筆者的研究發(fā)現(xiàn)諾考達(dá)唑可阻斷大鼠血管平滑肌細(xì)胞的增殖狀態(tài)并降低其能量代謝,可能與Mfn-2抑制平滑肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制有關(guān)。通過細(xì)胞周期的各個階段的啟動和后續(xù)進(jìn)展的精確控制細(xì)胞增殖至關(guān)重要。胸腺嘧啶核苷與諾考達(dá)唑是研究細(xì)胞周期中常用的誘導(dǎo)藥物。胸腺嘧啶核苷作為一種常用的DNA合成抑制藥可逆地抑制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其他細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn),將處于不同時相的細(xì)胞群體阻斷在G1/S期交界處;諾考達(dá)唑是一種紡錘體抑制藥,可抑制紡錘體的形成及功能,最終可將細(xì)胞群體阻斷在G2/M期,細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的核內(nèi)復(fù)制,導(dǎo)致多倍體細(xì)胞的形成,失去細(xì)胞正常的增殖功能。

通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),諾考達(dá)唑阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài)的同時,rVSMCs的線粒體的形態(tài)、分布與能量代謝均發(fā)生了明顯的變化。這提示諾考達(dá)唑阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài)與線粒體中的某種物質(zhì)有關(guān)。筆者研究發(fā)現(xiàn)諾考達(dá)唑處理后rVSMCs中Mfn-2的表達(dá)較增殖期升高,故而推測諾考達(dá)唑阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài)與Mfn-2有關(guān)。Mfn-2是分布于線粒體外膜與線粒體融合與分裂相關(guān)的蛋白質(zhì)。筆者早期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí),抑制Mfn-2的表達(dá)會導(dǎo)致rVSMCs的增殖[1],增強(qiáng)Mfn-2的表達(dá)可抑制rVSMCs的增殖[4]。實(shí)驗(yàn)顯示增殖期C組的rVSMCs線粒體較A組明顯腫脹,胸腺嘧啶核苷聯(lián)合諾考達(dá)唑處理后rVSMCs線粒體的體積明顯縮小,數(shù)量驟減,并出現(xiàn)大量的自噬體,同時,細(xì)胞停滯生長期B組線粒體的體積也比較小,也有一部分自噬體,即諾考達(dá)唑處理后細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與B組非常相似。與增殖期相比,諾考達(dá)唑處理后rVSMCs糖代謝、氨基酸代謝水平明顯降低,ATP的產(chǎn)生銳減, NADH的水平明顯增多而NAD的水平明顯降低。這可能是由于糖代謝、氨基酸代謝均檢測的是胞質(zhì)中的代謝水平,諾考達(dá)唑處理后rVSMCs發(fā)生嚴(yán)重的核內(nèi)復(fù)制,其糖代謝主要依賴糖酵解,代謝水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于糖氧化,故ATP的生成明顯減少,三羧酸循環(huán)的限速酶NADH的產(chǎn)生也顯著減少;其氨基酸代謝的來源主要為核內(nèi)氨基酸,代謝水平也降低。而且諾考達(dá)唑處理后rVSMCs代謝水平與B組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,B組與諾考達(dá)唑處理后rVSMCs中Mfn-2的表達(dá)均比C組增高。提示諾考達(dá)唑可能通過誘導(dǎo)rVSMCs中Mfn-2的表達(dá)來阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài)。在線粒體內(nèi)Mfn-2在鈣離子介導(dǎo)的NADH的產(chǎn)生中起著關(guān)鍵的作用[5-6],Mfn-2可介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體的融合[7-8],導(dǎo)致線粒體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取鈣離子促進(jìn)葡萄糖氧化,三羧酸循環(huán)限速酶NADH的產(chǎn)生增加。

總之,諾考達(dá)唑可阻斷rVSMCs的增殖狀態(tài),導(dǎo)致rVSMCs的線粒體的體積縮小、數(shù)量減少,能量代謝降低,可能與Mfn-2有關(guān),相關(guān)的分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.08.007

Effect and Underlying Mechanism of Nocodazole on Inhibition of Rat Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation

LI Dan,GUO Xiao-mei
(Department of Cardiology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To investigate the effect and underlying mechanism of nocodazole on the inhibition of rVSMCs proliferation.MethodsrVSMCs were divided into four groups,group A(normal culture),group B(serum-free culture for 24 h),group C(18 h normal culture after 48 h of serum-free culture),and group D(nocodazole treatment for 12 h after thymidine treatment for 12 h).Flow cytometry,transmission electron microscopy,and metabolism measurements were performed and mitofusin-2(Mfn-2)expression was detected.ResultsFlow cytometry analysis showed rVSMCs of group B、C、D were arrested to G0/G1,S and G2/M phases,respectively.Less and smaller mitochondria were observed in group D by transmission electron microscopy in nocodazole-treated rVSMCs.Compared with groups A and C,there were significant decreases in glucose and L-amino acid metabolism,levels of ATP,and marked increase in NADH in group D(P＜0.05).Western Blot showed that G2/M cell cycle arrest and nocodazole could induce up-regulation of Mfn-2 in rVSMCs(P＜0.05).ConclusionNocodazole can block the energy metabolism and proliferation in rVSMCs,which is probably associated with the role of Mfn-2 on antiatherosclerosis.

Nocodazole;Proliferation,vascular smooth muscle cells;Rat;Metabolism,energy;Mitofusin-2,energy; Atherosclerosis

R972.6;R965

A

1004-0781(2014)08-1004-05

2014-01-02

2014-03-08

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30872714)

李丹(1980-),女,湖北鄂州人,在讀博士,研究方向:分子心臟病學(xué)。電話:027-83663608,E-mail:tjhlidan@126.com。

郭小梅(1959-),男,湖北大冶人,主任醫(yī)師,教授,博士,研究方向:分子心臟病學(xué)。電話:027-83663608,E-mail:xmguo @tjh.tjmu.edu.cn。