仲蕾,徐立平,錢先中,金慧靜,陳超,仵利軍

(解放軍第100醫(yī)院藥械科,蘇州 215007)

丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞的促凋亡作用

仲蕾,徐立平,錢先中,金慧靜,陳超,仵利軍

(解放軍第100醫(yī)院藥械科,蘇州 215007)

目的 研究丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞凋亡的作用。方法將0,2,4,8μL·mL-1丹紅注射液分別作用人肝癌細胞系SMMC-7721,在顯微鏡下觀察不同濃度丹紅注射液對細胞形態(tài)的影響,選擇2μL·mL-1作用后,0, 6,12,24 h流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù)變化;以噻唑藍(MTT)法檢測不同濃度丹紅注射液對SMMC-7721肝癌細胞增殖的影響;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測p53、Bax、Bcl-2在含不同濃度藥物的SMMC-7721細胞中表達。結(jié)果隨著藥物濃度增大,SMMC-7721的凋亡形態(tài)越明顯,并且隨作用時間的延長,細胞凋亡指數(shù)也增加;不同濃度丹紅注射液對SMMC-7721細胞均有明顯的劑量和時間依賴性;不同濃度藥物可誘導(dǎo)SMMC-7721肝癌細胞凋亡;隨著丹紅注射液濃度增加,Bcl-2在SMMC-7721細胞中的表達降低,p53和Bax的表達增高。結(jié)論丹紅注射液能促進SMMC-7721細胞的凋亡,且具有一定的劑量和時間依賴性。

丹紅注射液;SMMC-7721肝癌細胞;凋亡

丹紅注射液是將中藥丹參、紅花按科學(xué)配方提取的復(fù)方制劑。丹參為唇形科植物,具有活血祛痕、養(yǎng)血安神、調(diào)經(jīng)鎮(zhèn)痛、涼血消癰的功效。紅花為菊科植物的干燥管狀花,具有活血通經(jīng)、散癖鎮(zhèn)痛的功效。研究表明,活血化瘀藥物可抑制肝癌細胞生長,促進腫瘤細胞凋亡,而丹紅注射液是常用的活血化瘀藥物,故筆者選擇此藥做進一步研究。丹參主要通過抑制細胞增殖、促進凋亡以及促進分化等機制發(fā)揮抗腫瘤作用,對多種腫瘤細胞具有生長抑制作用和分化誘導(dǎo)作用[1]。體外研究表明,丹參類化合物可抑制多種腫瘤細胞增殖,影響細胞周期分布。筆者主要研究丹紅注射液對SMMC-7721細胞毒性和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株SMMC-7721由蘇州大學(xué)細胞與分子教研室提供。細胞培養(yǎng)于RPMI1640 (GIBCO公司)培養(yǎng)液中,含10%滅活小牛血清, 37℃,5%二氧化碳(CO2)。

1.2 藥物處理 丹紅注射液(10 mL,6支),由菏澤步長制藥有限公司生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字Z20026866。細胞按2×105接種于6孔板中,待細胞貼壁后,根據(jù)預(yù)實驗及臨床用藥量,將丹紅注射液作用濃度按0,2,4,8μL·mL-1分組,每孔2 mL,以0μL·mL-1為陰性對照組。藥物共同作用3 d后,進行以下指標(biāo)觀察。

1.3 細胞凋亡形態(tài)觀察及細胞凋亡指數(shù)的測定 細胞按每孔2×105個接種于6孔板中,待細胞貼壁后,根據(jù)預(yù)實驗及臨床用藥量,將丹紅注射液作用濃度按0, 2,4,8μL·mL-1分組,加藥作用3 d后在顯微鏡下觀察,攝相。每孔2 mL,以0μL·mL-1為陰性對照組,其后以2μL·m L-1作用肝癌細胞,分別于0,6,12,24 h收集細胞,流式細胞儀檢測各時間點細胞的凋亡指數(shù)。

1.4 噻唑藍法檢測丹紅注射液對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用 取處于對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞,按每孔5×103個接種于96孔板,分別于鋪板第1, 2,3天時每孔加入5 mg·mL-1噻唑藍溶液10μL,置于細胞培養(yǎng)箱中作用4 h,然后每孔加入10%十二烷基苯磺酸鈉-鹽酸溶液100μL以溶解細胞內(nèi)形成的藍紫色結(jié)晶體,作用3～6 h。第4天時酶標(biāo)儀570 nm處測定吸光度(A570)值,每個時間設(shè)3個復(fù)孔。按以下公式計算促進/抑制率:細胞增殖促進/抑制率(%)= (1-實驗組A570值/對照組A570值)×100%

1.5 膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染檢測細胞凋亡 用0.25%不含依地酸二鈉的胰蛋白酶溶液消化各組細胞,制成單細胞懸液后移入1.5 mL離心管中,2 000 r·min-1(r=8 cm)離心5 min；加入磷酸鹽緩沖溶液洗滌細胞沉淀2次,收集(1～5)×105個細胞；加入重懸細胞結(jié)合緩沖液500μL；加入Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)溶液5μL混勻,加入PI溶液5μL,混勻,室溫,避光反應(yīng)15 min；1 h內(nèi)進行流式細胞儀檢測,激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptasepolymerase chain recation,RT-PCR)檢測凋亡相關(guān)基因在SMMC-7721細胞中的表達

1.6.1 總RNA的抽提 用胰酶消化收集各組細胞(各約106個)于無菌的1.5 mL離心管中；用磷酸鹽緩沖溶液洗滌一次細胞后加入Trizol試劑1 mL,劇烈振蕩至細胞沉淀充分溶解消失；加入三氯甲烷溶液200μL,劇烈顛倒20次,充分混勻,放置5 min,4℃、12 000×g離心15 min；棄去上清液,干燥,加焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate,DEPC)溶液20～50μL溶解沉淀。

1.6.2 RT-PCR反應(yīng) 用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20μL合成cDNA,以所得到的cDNA作為模板,進行PCR擴增。取PCR產(chǎn)物和DNA Marker各5μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

p53:上游引物5′-TTG GAT CCA TGT TTT GCC AAC TGG CC-3′

下游引物5′-TTG AAT TCA GGC TCC CCT TTC TTG CG-3′

Bcl-2:上游引物5′-TGT GGC CTT CTT TGA ATT CG-3′

下游引物5′-CTA CCC AGC CTC CGT TAT CC-3′

Bax:上游引物5′-GGA TGCGTCCAC CAA GAA-3′

下游引物5′-GCA CTC CCG CCA CAA AGA-3′

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH):上游引物5′-TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA-3′

下游引物5′-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3′

2 結(jié)果

2.1 丹紅注射液對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響及細胞凋亡指數(shù)的測定

2.1.1 丹紅注射液對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響SMMC-7721細胞按不同加藥濃度進行培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察。對照組細胞密度高,體積規(guī)則呈正常梭形,正常細胞98%,凋亡細胞2%。隨著藥物濃度的增大,凋亡細胞明顯增多,細胞由梭形變成圓形,皺縮、部分細胞從瓶壁脫落,懸浮在培養(yǎng)液中。隨加藥劑量增大,細胞脫落增加。2μL·m L-1劑量組開始出現(xiàn)凋亡狀態(tài),8μL·m L-1劑量組細胞基本脫落死亡(圖1)。

2.1.2 細胞凋亡指數(shù)的測定 凋亡指數(shù)為凋亡細胞所占測定細胞總數(shù)的百分率,選用2μL·mL-1丹紅注射液進一步觀察,以0 h未加藥時為對照組,6及12 h時肝癌細胞凋亡指數(shù)較對照組逐漸增加(圖2),作用24 h后細胞凋亡指數(shù)與對照組0 h比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 丹紅注射液對SMMC-7721細胞增殖的抑制作用

不同濃度的丹紅注射液分別給藥24,48,72 h后,對SMMC-7721細胞的生長呈明顯抑制作用(圖3)。結(jié)果表明細胞增殖的抑制率與藥物濃度及作用時間密切相關(guān),單因素方差分析結(jié)果表明不同藥物濃度與對照組間細胞抑制率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),隨著藥物濃度和作用時間的增加,對細胞增殖的抑制作用越明顯。

2.3 丹紅注射液誘導(dǎo)SMMC-7721細胞凋亡的作用SMMC-7721細胞經(jīng)不同組別處理,PI染色后使用流式細胞儀進行監(jiān)測分析。結(jié)果表明:丹紅注射液可以誘導(dǎo)細胞凋亡,隨給藥時間的增加誘導(dǎo)細胞凋亡的作用逐漸增強。對照組凋亡比例為7.63%,給藥后的細胞凋亡比例升高,2,4,8μL·mL-1丹紅注射液組細胞凋亡比例分別為8.28%,12.35%,33.86%,與對照組比較均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P＜0.05)。細胞凋亡比例隨藥物濃度增大而逐漸增大(圖4,5)。

2.4 RT-PCR檢測細胞中凋亡相關(guān)基因的表達 抗凋亡基因Bcl-2與促凋亡基因Bax是Bcl-2家族成員,二者比例決定了細胞對凋亡信號的反應(yīng)。RT-PCR法檢測促凋亡基因Bax、p53和抗凋亡基因Bcl-2轉(zhuǎn)錄情況。與對照組相比,丹紅注射液組促凋亡基因Bax mRNA和p53 mRNA表達量隨著加藥劑量的升高而增強；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表達量隨著加藥劑量的升高而下降(圖6)。利用Bandscan軟件掃描半定量分析條帶的灰度值,結(jié)果見圖7,與對照組相比,促凋亡基因Bax和p53 mRNA相對表達量相對增加(P＜0.05)；抗凋亡基因Bcl-2相對表達量降低(P＜0.05)。

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·mL-1丹紅注射液組圖1 4組細胞形態(tài)觀察(40×10)A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong Injection groupFig.1 Morphology of four groups of cells(40×10)

圖2 2μL·m L-1丹紅注射液處理SMMC-7721細胞24 h細胞凋亡指數(shù)的變化Fig.2 Apoptosis index of SMMC-7721 cells after treatment w ith 2μL·m L-1danhong injection for 24 h

圖3 丹紅注射液對SMMC-7721細胞生長的作用Fig.3 Effect of danhong injection on the grow th of hepatoma cells

3 討論

腫瘤是在遺傳基礎(chǔ)上多種致瘤因素作用的結(jié)果,細胞失去了正常分化的能力,異常增殖形成新生物,喪失了正常的生理功能。惡性腫瘤具有局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的特性。本研究顯示,丹紅注射液作用后,SMMC-7721細胞一部分發(fā)生凋亡,且具有時間和劑量依賴性,隨著藥物劑量的增加,細胞的凋亡率增大。經(jīng)典的細胞凋亡途徑包括受體介導(dǎo)途徑和線粒體介導(dǎo)途徑。線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑通過Bcl-2家族調(diào)節(jié)。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白[2-3]。抗凋亡蛋白Bc1-2與促凋亡蛋白Bax的比例,即Bcl-2/Bax異源二聚體與Bax/Bax同源二聚體的比例,決定了細胞對凋亡信號的反應(yīng),即生存還是死亡[4]。Bax是一種很重要的促凋亡基因,其表達產(chǎn)物常以Bax/Bax同源二聚體形成來誘導(dǎo)細胞凋亡,起到加速細胞凋亡的作用。

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·mL-1丹紅注射液組圖4 4組細胞的凋亡圖A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.4 Apoptosis of fou r groups of cells

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·m L-1丹紅注射液組圖5 4組細胞的凋亡指數(shù)比較A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·mL-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.5 Comparison of the apoptosis index am ong 4 groups of cells

A.對照組;B.2μL·mL-1丹紅注射液組;C.4μL·mL-1丹紅注射液組;D.8μL·m L-1丹紅注射液組圖6 4組細胞凋亡相關(guān)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平A.the control group；B.2μL·mL-1danhong injection group；C.4μL·m L-1danhong injection group；D.8μL·mL-1danhong injection groupFig.6 mRNA transcription levels of apoptosis related gene in four groups of cells

圖7 Bax、p53和Bcl-2在4組細胞株中的mRNA表達Fig.7 mRNA expression of Bax,p53 and Bcl-2 in four groups of cells

筆者采用RT-PCR法檢測了凋亡相關(guān)基因的變化,結(jié)果表明促凋亡基因Bax和p53表達上調(diào),抗凋亡基因Bcl-2表達下調(diào),故其Bax/Bcl-2明顯升高,提示丹紅注射液抗凋亡可能是通過上調(diào)Bax表達和下調(diào)Bcl-2表達實現(xiàn)的。但目前其作用機制尚不明確,有待于進一步研究。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與細胞的分化異常及增殖過度有關(guān),而且與細胞凋亡的減少密切相關(guān),而一旦細胞增殖與凋亡失控,則可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[5]。本研究將結(jié)果顯示,丹紅注射液能抑制肝癌的生長,并能誘導(dǎo)其凋亡,這為傳統(tǒng)中藥用于腫瘤治療開拓了新的思路。

[1] 鄭謹,劉強,史恒軍,等.丹紅注射液促肝癌細胞凋亡及NDRG2表達的初步研究[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2010, 41(12):1009-1010.

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.004

Pro-Apoptosis Effects of Danhong Injection on the SMMC-7721 Hepatoma Cells

ZHONG Lei,XU Li-ping,QIAN Xian-zhong,JIN Hui-jing,CHEN Chao,WU Li-jun
(Department of Pharmacy and Apparatus,the 100thHospital of PLA,Suzhou 215007,China)

ObjectiveTo investigate the effects ofdanhonginjection on theapoptosis of SMMC-7721 heptoma cells.MethodsThe hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was incubated with different concentrations(0,2,4,8μL·mL-1) ofdanhonginjection,and cellmorphology was studied under themicroscope.The apoptosis index was detected by flow cytometry at 0,6,12,24 h after cultured with 2μL·m L-1danhonginjection.Cell proliferation was measured by MTT assay;Gene expressions of p53,Bax and Bcl-2 were detected by RT-PCR at different drug concentrations.ResultsThemorphology of the hepatoma cells changed obviously,and the apoptosis index increased bydanhonginjection in a dose-dependant manner.Thedanhonginjection decreased gene expressions of Bcl-2,and obviously increased p53 and Bax.ConclusionDanhonginjection can dose-and time-dependently promote apoptosis of SMMC-7721 cells.

Danhonginjection;SMMC-7721 hepatoma cells;Apoptosis

R286;R979.1

A

1004-0781(2014)05-0565-04

2013-03-22

2013-05-07

仲蕾(1987-),女,江蘇蘇州人,碩士,研究方向:藥理學(xué)。電話:(0)18629057786,E-mail:zhongleiqin@126.com。

仵利軍(1978-),男,浙江湖州人,主管藥師,研究方向:藥事管理學(xué)。電話:(0)15195607766,E-mail:410385634@qq.com。