趙雪,于沛濤,徐芝君,顧清,裘力鋒,王弋

(1.杭州市第一人民醫(yī)院急診科,杭州 310003；2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京 100191)

急診重癥監(jiān)護(hù)病房感染患者耐氨基苷鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制

趙雪1,于沛濤2,徐芝君1,顧清1,裘力鋒1,王弋1

(1.杭州市第一人民醫(yī)院急診科,杭州 310003；2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,北京 100191)

目的 研究急診重癥監(jiān)護(hù)病房(EICU)感染患者鮑曼不動(dòng)桿菌16S rRNA甲基化酶armA、氨基苷核苷轉(zhuǎn)移酶ANT(3′′)-Ia、氨基苷磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3′)-I、氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(6′)-Ib檢出率,分析耐氨基苷鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制。方法收集48株鮑曼不動(dòng)桿菌均經(jīng)VITEK系統(tǒng)鑒定,并采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測(cè)定最低抑菌濃度(MIC),采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法檢測(cè)酶基因。結(jié)果48株鮑曼不動(dòng)桿菌中氨基苷類抗菌藥物高耐藥菌株28株,低耐藥菌株20株。高耐藥菌16S rRNA armA和低耐藥菌16S rRNA armA檢出率分別為71.43%和0.00%(P＜0.01),高耐藥菌APH (3′)-I和低耐藥菌APH(3′)-I檢出率分別為60.71%和5.00%(P＜0.01),高耐藥菌ANT(3′′)-Ia和低耐藥菌ANT(3′′)-Ia檢出率分別為82.14%和5.00%(P＜0.01),高耐藥菌AAC(6′)-Ib和低耐藥菌AAC(6′)-Ib檢出率分別為53.57%和5.00%(P＜0.01)。結(jié)論氨基苷鈍化酶和16S rRNA甲基化酶在氨基苷高耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中檢出率高,與氨基苷類抗菌藥物高耐藥密切相關(guān)。

鮑曼不動(dòng)桿菌;氨基苷鈍化酶基因;16S rRNA甲基化酶基因;重癥監(jiān)護(hù)病房,急診

鮑曼不動(dòng)桿菌近年來已成為常見醫(yī)院感染致病菌,因其高檢出率和高耐藥率而受到高度關(guān)注。急診重癥監(jiān)護(hù)病房(emergency intensive care unit,EICU)患者分離鮑曼不動(dòng)桿菌亦逐年增多,鮑曼不動(dòng)桿菌已成為EICU患者感染主要致病菌之一[1]。隨著抗菌藥物廣泛應(yīng)用,鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨基苷類、喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物均呈現(xiàn)藥耐性,16S rRNA甲基化酶可使所有氨基苷類抗菌藥物失活[2]。編碼16S rRNA甲基化酶的基因主要包括rmtA、rm tB、rm tC、rm tD、rmtE、armA和npmA等7種,其中主要檢出的是armA亞型[3-4]。氨基苷類抗菌藥物耐藥主要機(jī)制為細(xì)菌產(chǎn)生鈍化酶[5],鈍化酶主要包括氨基苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside phosphotransferases,APH)、氨基苷核苷轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside nucleotidyltransferases, ANT)、氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(aminoglycoside acetyltransferases,AAC)三類,共三十余種[6]。為了分析EICU耐氨基苷鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥相關(guān)基因狀況,筆者檢測(cè)了從EICU感染患者分離鮑曼不動(dòng)桿菌具有代表性的基因:16S rRNA甲基化酶armA、氨基苷核苷轉(zhuǎn)移酶ANT(3′′)-Ia、氨基苷磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3′)-I、氨基苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(6′)-Ib,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年1月～2012年12月,EICU感染患者分離鮑曼不動(dòng)桿菌48株,感染部位主要是下呼吸道和尿道,分別占57.6%和22.4%。收集1周內(nèi)或住院期間反復(fù)培養(yǎng)出現(xiàn)的同部位相同菌株,不重復(fù)統(tǒng)計(jì)。

1.2 培養(yǎng)和鑒定 按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(2005年版)臨床微生物常規(guī)鑒定程序操作培養(yǎng),用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK系統(tǒng)鑒定。

1.3 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)測(cè)定 采用瓊脂對(duì)倍稀釋法測(cè)定菌株對(duì)抗菌藥物的MIC,藥敏結(jié)果判斷按2010年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.4 質(zhì)控菌株 采用銅綠假單胞菌ATCC27853、大腸埃希菌ATCC25922、鮑曼不動(dòng)桿菌ATC19606。

1.5 儀器與試劑 試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)基因擴(kuò)增儀(型號(hào):TProfessional Trio,德國(guó)Whatman Biometra公司)

1.6 方法 以阿米卡星MIC≥256μg·m L-1為標(biāo)準(zhǔn)[7],高于該值為高耐藥菌,低于該值為低耐藥菌。氨基苷鈍化酶基因PCR擴(kuò)增[8],以GenBank中基因序列設(shè)計(jì)引物,引物序列見表1,退火溫度均為55℃。上下游引物各1μL,模板液2μL,PCR預(yù)混液12.5μL,余量超輕水補(bǔ)足至25μL。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物,用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0版軟件進(jìn)行Χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥菌 高耐藥菌和低耐藥菌分別為28和20株。

2.2 氨基苷鈍化酶基因測(cè)序 經(jīng)ABI自動(dòng)DNA測(cè)序儀測(cè)序,與GenBank已登錄的基因序列比對(duì),同源性為99%,16S rRNA armA、APH(3′)-I、ANT(3′′)-Ia、 AAC(6′)-Ib基因序列登錄號(hào)分別為EU140571、ACYR02000001、GU304661、EF690695。

表1 氨基苷鈍化酶基因PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 PCR amplification primers of aminoglycoside-modifying enzymes gene

2.3 16S rRNA甲基化酶和氨基苷鈍化酶基因在高耐藥菌和低耐藥菌中檢出率比較 高耐藥菌ANT(3′′)-Ia檢出率最高,其次是16S rRNA armA,低耐藥菌未檢測(cè)到16S rRNA armA,見表2。

2.4 16S rRNA甲基化酶和氨基苷鈍化酶基因檢出情況 高耐藥菌16S rRNA armA、APH(3′)-I、ANT(3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib 4種酶基因都檢測(cè)到的菌株數(shù)最多,共9株,見表3。低耐藥菌1株檢出APH(3′)-I、ANT(3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib 3種鈍化酶基因,其他均未檢出。

3 討論

氨基苷類抗菌藥物耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌已經(jīng)成為院內(nèi)感染的主要病原菌之一,且多為高水平耐藥,其主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生鈍化酶[3],以及新近發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生16S rRNA甲基化酶[2]等。不同的鈍化酶有相對(duì)應(yīng)的特異性作用底物,通常介導(dǎo)一種或幾種相似結(jié)構(gòu)的氨基苷類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性[9],16S rRNA甲基化酶由質(zhì)粒介導(dǎo)。

表2 16S rRNA甲基化酶和氨基苷鈍化酶基因在高耐藥菌和低耐藥菌中檢出率Tab.2 Detection rate of am inoglycoside-mod ifying enzym es gene and 16S rRNA methylase gene in high resistant and low resistant Acinetobacter baumannii

氨基苷類抗菌藥物MIC為256μg·mL-1時(shí)具有陽性預(yù)測(cè)意義[7]。本研究以阿米卡星MIC≥256μg·mL-1的菌株為高耐藥菌株,MIC＜256μg·mL-1的菌株為低耐藥菌株。分離的48株鮑曼不動(dòng)桿菌中, 28株為高耐藥菌株,20株為低耐藥菌株。

表3 高耐藥菌中16S rRNA arm A、APH(3′)-I、ANT (3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib 4種酶基因檢出情況Tab.3 Detection on 16S rRNA arm A、APH(3′)-I、ANT (3′′)-Ia、AAC(6′)-Ib gene in highly resistan t Acinetobacter baumannii

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,EICU患者中分離的鮑曼不動(dòng)桿菌高耐藥株攜帶16S rRNA armA基因陽性率較高,氨基苷鈍化酶基因核苷轉(zhuǎn)移酶ANT(3′′)-Ia、磷酸轉(zhuǎn)移酶APH(3′)-I、乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC(6′)-Ib陽性率依次降低。不同地區(qū)鈍化酶差異較大,美國(guó)以ANT(2′′)最常見,日本以AAC(6′)常見,可能與不同地區(qū)抗菌藥物應(yīng)用差異較大有關(guān)。

同時(shí)檢出3種鈍化酶基因的菌株,對(duì)氨基苷類抗菌藥物均呈現(xiàn)高度耐藥,原因應(yīng)為3種基因表達(dá)產(chǎn)物作用底物覆蓋了所有氨基苷類抗菌藥物；而僅檢出一種或兩種鈍化酶基因的菌株,對(duì)不同氨基苷類抗菌藥物中有些品種存在低耐藥或敏感菌株,其機(jī)制應(yīng)與只介導(dǎo)一種或幾種相似結(jié)構(gòu)的氨基苷類抗菌藥物有關(guān)[9],如APH(3′)-I對(duì)卡那霉素、核糖霉素、新霉素等產(chǎn)生耐藥性,ANT(3′′)-I對(duì)鏈霉素、大觀霉素等產(chǎn)生耐藥性,AAC(6′)-I對(duì)阿米卡星、奈替米星、妥布霉素等產(chǎn)生耐藥性。16S rRNA甲基化酶的出現(xiàn)給原有氨基苷類抗菌藥物針對(duì)拮抗鈍化酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的研發(fā)思路帶來很大的障礙。

本研究顯示,氨基苷類抗菌藥物高耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥與氨基苷鈍化酶和16S rRNA甲基化酶基因表達(dá)有關(guān),與DOI等[2]報(bào)道一致。1株未檢出氨基苷鈍化酶基因菌株呈現(xiàn)高耐藥,1株檢出3種鈍化酶基因菌株呈現(xiàn)低耐藥,說明鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜,存在其他耐藥機(jī)制,如:核糖體結(jié)合位點(diǎn)改變、外排泵過度表達(dá)、外膜孔蛋白表達(dá)缺失等,具體耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之,及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥菌株及流行趨勢(shì),可有效延緩細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,控制耐藥菌傳播,為臨床合理選用抗菌藥物提供依據(jù)。

[1] 趙雪,于沛濤,王弋,等.急診重癥監(jiān)護(hù)病房病原學(xué)調(diào)查及臨床分析[J].北京醫(yī)學(xué),2013,35(3):178-181.

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DOI 10.3870/yydb.2014.05.008

Drug Resistance Mechanism of Patients Infected with Aminoglycoside-resistant Acinetobacter Baumannii in Emergency Intensive Care Unit

ZHAO Xue1,YU Pei-tao2,XU Zhi-jun1,GU Qing1,QIU Li-feng1,WANG Yi1
(1.Department of Emergency,the First Poeple's Hospital of Hangzhou,Hangzhou 310003,China;2.School of Basic Medicine,Peking University, Beijing 100191,China)

ObjectiveTo investigate drug resistance mechanism of am inoglycoside-resistant Acinetobacter baumannii by detecting 16S rRNA methylase gene and three common genes of aminoglycoside-modifying enzymes in Acinetobacter baumannii infected patients at EICU.MethodsThe 48 Acinetobacter baumannii strains were collected,and antimicrobial susceptibility tests were performed by VITEK automicroscan.The MIC was detected by 2-fold agar dilutionmethod,and genes were analyzed by polymerase chain reaction(PCR).ResultsAmong48 strains,28 werehighly resistant to aminoglycosides and 20 showed lower resistances.The 16S rRNA armA,APH(3')-I,ANT(3'')-Ia,AAC(6')-Ib geneswere detected in 71.43%,60.71%,82.14%, and 53.57%of the 28 highly resistant strains,but only present in 0.00%,5.00%,5.00%,and 5.00%of the low-resistant isolates(P＜0.01).ConclusionThe aminoglycoside-modifying enzymes and 16S rRNA methylase were frequently found in Acinetobacter baumannii clinical isolates,which is closely related to the high-level resistance to aminoglycoside antibiotics.

Acinetobacter baumannii;Aminoglycoside-passivating enzymes genes;16S rRNA methylase gene; Intensive care unit,emergency

R978.12;R969.3

A

1004-0781(2014)05-0579-03

2013-07-05

2013-09-06

趙雪(1978-),男,浙江杭州人,主治醫(yī)師,在讀碩士,從事急診醫(yī)學(xué)研究。電話:(0)13750888506,E-mail:15130726@qq.com。

于沛濤(1969-),男,北京人,副教授,學(xué)士,從事基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究。電話:(0)13701096687,E-mail:yupeitao@126.com。