林雪松,向軍,蔡亞娜,汪樂(lè)

(1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院燒傷科,臺(tái)州 318000;2.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院燒傷科,上海 200025)

烏司他丁對(duì)內(nèi)毒素肺損傷大鼠的保護(hù)作用

林雪松1,向軍2,蔡亞娜1,汪樂(lè)1

(1.浙江省臺(tái)州市中心醫(yī)院燒傷科,臺(tái)州 318000;2.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院燒傷科,上海 200025)

目的 探討烏司他丁對(duì)急性內(nèi)毒素性肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制。方法取SD大鼠20只,大鼠腹腔注射脂多糖(LPS)5mg·kg-1·d-1,按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分配進(jìn)入烏司他丁組和對(duì)照組各10只。烏司他丁組靜脈給予烏司他丁50 kU·kg-1,對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液,觀察大鼠水通道蛋白-1(AQP-1),AQP-5的表達(dá)變化及肺泡壁厚度變化以及肺水腫的程度。結(jié)果對(duì)照組大鼠體內(nèi)注射LPS后,AQP-1及AQP-5的表達(dá)持續(xù)性降低,烏司他丁組AQP-1及AQP-5降低不明顯;對(duì)照組肺組織濕/干質(zhì)量比值明顯增高,烏司他丁組無(wú)明顯變化。對(duì)照組24,48,72 h的肺泡壁厚度(3.84±0.68),(6.32±1.08),(11.03±2.47)μm,烏司他丁組分別為(2.31±0.44),(3.76±0.82),(2.94±0.67)μm,無(wú)明顯變化。結(jié)論AQP-1及AQP-5通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性而導(dǎo)致肺水腫,烏司他丁通過(guò)減緩上述過(guò)程從而減輕內(nèi)毒素性肺損傷的程度。

烏司他丁;損傷,肺,急性;內(nèi)毒素;水通道蛋白

機(jī)體嚴(yán)重創(chuàng)傷及感染后常伴有急性肺損傷,可進(jìn)一步發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。ARDS最初的病理生理變化是肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,引起微血管壁通透性增加,肺泡內(nèi)及間質(zhì)水腫、纖維素滲出,并損傷肺泡上皮,加重呼吸窘迫。因此,肺微血管通透性增加是急性肺損傷及ARDS等病變的一個(gè)關(guān)鍵因素。許多研究證實(shí),通過(guò)抑制燒傷后炎癥反應(yīng),在一定程度上能改善燒傷后的臟器損傷。烏司他丁(ulinastatin)屬于蛋白酶抑制藥,有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶釋放及進(jìn)一步抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)的作用,廣泛應(yīng)用于大面積燒傷及急性胰腺炎患者[1]。本實(shí)驗(yàn)中,筆者一方面觀察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激后肺組織炎癥因子及水通道蛋白(aquaporin,AQP)等功能蛋白的變化,另一方面應(yīng)用烏司他丁觀察其對(duì)肺損傷的保護(hù)作用,從而初步探討烏司他丁對(duì)肺臟保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試藥及儀器 AQP-1及AQP-5單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。配膠試劑:30%丙烯酰胺、1.5 mol·L-1Tris(pH8.8)、10%過(guò)硫酸銨(APS)、10%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、雙蒸水等,電泳液:Tris 3.03 g,甘氨酸18.8 g,SDS 1 g,加純化水配制1 000 mL;轉(zhuǎn)膜液:Tris3.03 g,甘氨酸14.4 g,甲醇200 mL,加純化水配制1 000mL;封閉液:5%脫脂奶粉。主要儀器:多功能酶標(biāo)儀、電泳設(shè)備、轉(zhuǎn)膜設(shè)備、濕盒、掃描設(shè)備等。LPS為大腸埃希菌脂多糖,上?；鄯f生物科技有限公司,批號(hào):20111105);烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào):031004141)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模、分組 清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠20只,體質(zhì)量170～200 g,購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2009-0019,使用許可證號(hào):SYXK(滬)2009-0082。予標(biāo)準(zhǔn)飼料,自由取水。按5 mg·kg-1·d-1劑量腹腔注射LPS。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分配進(jìn)入烏司他丁組和對(duì)照組各10只。烏司他丁組靜脈給予烏司他丁50 kU·kg-1;對(duì)照組給予等量0.9%氯化鈉溶液。分別于注射LPS后0,24,48,72 h取材檢測(cè)。

1.3 肺組織標(biāo)本收集 取血完畢后,沿胸骨旁?shī)A斷肋骨,打開胸腔,暴露雙肺,自右側(cè)肺門游離右肺,速凍于液氮,保存于-80℃。

1.4 Western blot檢測(cè)肺組織AQP-1,AQP-5蛋白抽提肺組織總蛋白,測(cè)定肺組織總蛋白濃度,根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit,PIERCE)流程說(shuō)明書建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后行SDS-PAGE電泳及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移,膜的封閉和抗體孵育,將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育5 min;去除過(guò)量的溶液,將膜夾在兩塑料薄膜之間,以X光膠片曝光,顯影圖片掃描并用Image J分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

1.5 肺組織切片染色及肺泡壁厚度測(cè)定 隨機(jī)選取每個(gè)組的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5張?zhí)K木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)切片,每張切片隨機(jī)選取視野2個(gè),鏡下測(cè)量肺泡壁厚度,計(jì)算平均值。

1.6 肺組織濕/干質(zhì)量比值 從各組大鼠左下肺切取肺組織200 mg,置于烘箱內(nèi)80℃干烤24 h后,用托盤天平稱質(zhì)量并計(jì)算肺組織濕/干質(zhì)量(W/D)比值,以W/D比值表示肺組織含水量,比值越大說(shuō)明肺水腫越明顯。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12.0版醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件,變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),組內(nèi)比較采用Dunnett's方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 烏司他丁對(duì)AQP-1,AQP-5的影響 注射LPS后AQP-1及AQP-5的表達(dá)持續(xù)性降低,而同時(shí)注射烏司他丁后,AQP-1及AQP-5降低不明顯。見圖1,2。

2.2 肺組織濕/干質(zhì)量比值 注射LPS 48～72 h后,肺組織濕/干質(zhì)量比值明顯增高,而烏司他丁組肺組織濕/干質(zhì)量比值始終無(wú)明顯變化。見圖3。

2.3 肺泡壁厚度 注射LPS后,肺泡壁厚度明顯增大,而烏司他丁組肺泡壁厚度無(wú)明顯變化。見圖4,5。

A:對(duì)照組;B:烏司他丁組圖1 Western blot檢測(cè)AQP-1和AQP-5的表達(dá)A.Control group;B.Ulinastatin groupFig.1 Detection on exp ression of AQP-1 and AQP-5 by Western blotmethod

A.AQP-1;B.AQP-5;與對(duì)照組比較,*1P＜0.01;*2P＜0.05圖2 兩組不同時(shí)間AQP-1和AQP-5蛋白表達(dá)量A.AQP-1;B.AQP-5;Compared with the control group,*1P＜0.01;*2P＜0.05Fig.2 Expression of AQP-1 and AQP-5 between two groups in d ifferent time

3 討論

AQP對(duì)水的通透性具有高度選擇性,水分子可以通過(guò)水通道向高滲方向移動(dòng)[2]。AQP-1在呼吸道及肺都有表達(dá);AQP-5分布在Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞的頂膜上[1]。在肺泡上皮細(xì)胞的基底膜和側(cè)膜上以及呼吸道上皮細(xì)胞的頂膜上未發(fā)現(xiàn)AQP存在[3]。

與對(duì)照組比較,P＜0.01圖3 兩組不同時(shí)間肺組織濕/干質(zhì)量比Compared with the control group,*1P＜0.01Fig.3 The wet/dry weight ratio of two groups at different time points

與對(duì)照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01圖4 兩組不同時(shí)間肺泡壁厚度Compared with the control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01Fig.4 Thickness of alveolar walls of two groups at different time points

A、B、C為對(duì)照組24,48,72 h;D、E、F為烏司他丁組24,48,72 h圖5 兩組肺組織切片染色圖(HE,×400)A,B,Cwere control groups in 24,48,72 h,respectively;D,E,F were ulinastatin groups in 24,48,72 h,respectivelyFig.5 Lung histopathology of two groups of mice(HE,×400)

嚴(yán)重的大面積燒傷常伴有急性肺損傷,作為一種蛋白酶抑制藥,烏司他丁具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶釋放及進(jìn)一步抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)的作用[1],廣泛應(yīng)用于大面積燒傷患者。

肺組織濕/干質(zhì)量比及肺泡壁厚度反映肺水腫的程度,經(jīng)LPS刺激后,肺組織的水腫程度持續(xù)性加重,經(jīng)烏司他丁干預(yù)后,肺組織濕/干質(zhì)量比值及肺泡壁厚度變化不大,提示烏司他丁的重要的保護(hù)作用。

肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增加導(dǎo)致肺水腫,內(nèi)皮細(xì)胞通透性包括透細(xì)胞通透性及旁細(xì)胞通透性,內(nèi)皮細(xì)胞膜表面有多種調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性的蛋白,如AQP、caveolin及鈉通道,在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)LPS可下調(diào)AQP-1及AQP-5,而烏司他丁干預(yù)后,AQP-1及AQP-5表達(dá)無(wú)明顯變化,同樣也提示烏司他丁對(duì)肺組織的重要的保護(hù)作用。在以往關(guān)于LPS或燒傷對(duì)肺組織AQP的影響的研究中發(fā)現(xiàn),燒傷先引起肺組織AQP-1上調(diào)隨后下調(diào)表達(dá),下調(diào)肺組織AQP-5的表達(dá),其中關(guān)于AQP-1的研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不一致。筆者推測(cè)LPS刺激或燒傷后AQP-1的上調(diào)表達(dá)可能發(fā)生在較短時(shí)間內(nèi),即發(fā)生在LPS刺激早期,是對(duì)LPS刺激的急性反應(yīng),或者說(shuō)是對(duì)LPS刺激后機(jī)體產(chǎn)生的代償性保護(hù)作用。而在LPS持續(xù)的不間斷的刺激下,機(jī)體產(chǎn)生對(duì)LPS的不同程度的耐受,這種保護(hù)性代償反應(yīng)隨之消失,使AQP-1表達(dá)下調(diào),肺組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)失調(diào),肺水腫逐漸加重。

[1] ZHANG Y W,BI L T,HOU SP,et al.Reduced lung water transport rate associated with downregulation of aquaporin-1 and aquaporin-5 in aged mice[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2009,36(7):734-738.

[2] ECHEVARRIA M,MUNOZ-CABELLO A M,SANCHEZSILVA R,et al.Development of cytosolic hypoxia and hypoxiainducible factor stabilization are facilitated by aquaporin-1 expression[J].J Biol Chem,2007,282(41):30207-30215.

[3] GAO C,HUAN J,LIW,et al.Protective effects of ulinastatin on pancreatic and renal damage in rats following early scald injury[J].Burns,2009,35(4):547-552.

DOI 10.3870/yydb.2014.06.006

Protective Effect of Ulinastatin on LPS-induced Lung Injury

LIN Xue-song,XIANG Jun,CAI Ya-na,WANG Le
(1.Department of Burn,Taizhou Central Hospital, Taizhou 318000,China;2.Department of Burn&Plastic Surgery,Ruijin Hospital,Shanghai Jiaotong University,Shanghai 200025,China)

ObjectiveTo investigate the protection mechanism of ulinastatin on bacterial endotoxin-induced acute lung injury.MethodsAcute lung injury was induced by Escherichia colilipo-polysaccharide(LPS)5 mg·kg-1·d-1,intratracheally. Twenty SD ratswere randomly divided into controlgroup(n=10)and ulinastatin group(n=10).Ulinastatid group received ulinastatin 50 kU·kg-1,the control groups received the same amount of 0.9%sodium chloride solution.Then the expression changes of rat AQP-1 and AQP-5,alveolar wall thickness change and the degree of pulmonary edema were detected.ResultsAfter the injection of LPS into the rat,the expression of AQP-1 and AQP-5 in control group were continuously decreased,but those in ulinastatin group decreased were not obvious.The lung wet/dry weight ratio in the control group increased significantly,the not obvious changes in the ulinastain group.The thickness of the alveolar in 24,48,72 h of the control group were(3.84±0.68),(6.32±1.08),(11.03±2.47)μm, respectively,and those in the ulinastian groupswere(2.31±0.44),(3.76±0.82),(2.94±0.67)μm,respectively.ConclusionThe AQP-1 and AQP-5 induced the occurrence of pulmonary edema by changing the cell permeability.Ulinastatin can slow down the process so as to reduce the degree of endotoxin-induced lung injury.

Ulinastatin;Injury,lung,acute;Endotoxin;Aquaporin

R965

A

1004-0781(2014)06-0718-04

2013-10-15

2014-01-20

林雪松(1970-),男,浙江臺(tái)州人,副主任醫(yī)師,學(xué)士,從事燒傷外科臨床工作。電話:(0)15257699000,E-mail:linxuesg@163.com。

向軍(1968-),男,上海人,副主任醫(yī)師,碩士,從事燒傷科工作。電話:(0)13801789791,E-mail:13801789791@163.com。