熊婧，李霞，曾凡波，陳鵬，翟莉

(1.武漢健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，武漢 430052；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

鱉甲煎丸對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性的實(shí)驗(yàn)研究

熊婧1，李霞1，曾凡波2，陳鵬1，翟莉1

(1.武漢健民藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，武漢 430052；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，武漢 430030)

目的 觀察鱉甲煎丸對(duì)大鼠的毒性反應(yīng),確定其安全劑量,為擬定人用劑量提供參考。方法SD大鼠60只,隨機(jī)分為鱉甲煎丸低、高劑量組和對(duì)照組,每組20只,分別灌胃給予低、高劑量鱉甲煎丸藥液(相當(dāng)于生藥5, 10 g·kg-1)和純化水2mL,連續(xù)給予6個(gè)月。觀察大鼠一般狀況、體質(zhì)量及進(jìn)食量,給藥結(jié)束及停藥4周后檢查血常規(guī)、血液生化學(xué)指標(biāo)及臟器系數(shù)、組織病理學(xué)變化。結(jié)果鱉甲煎丸低、高劑量組大鼠一般狀況、體質(zhì)量、進(jìn)食量、血常規(guī)、血液生化學(xué)指標(biāo)及臟器系數(shù)與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,亦未見(jiàn)異常組織病理學(xué)變化。結(jié)論鱉甲煎丸對(duì)大鼠血常規(guī)、血液生化學(xué)指標(biāo)無(wú)明顯影響,對(duì)臟器的長(zhǎng)期毒性低,未發(fā)現(xiàn)毒性靶器官,長(zhǎng)期服用安全。

鱉甲煎丸；毒性,長(zhǎng)期；大鼠

鱉甲煎丸源于張仲景《金匱要略·瘧癥》篇,具活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之功效,用于脅下癥塊［1-3］。臨床上除用于治療因瘧疾等各種原因引起的肝脾大、肝硬化等癥外,也用于惡性腫瘤的治療,且在治療子宮肌瘤、黃褐斑、心絞痛及高脂血癥等方面亦取得較好療效［3］,但對(duì)鱉甲煎丸的長(zhǎng)期毒性研究筆者鮮見(jiàn)報(bào)道。為探討鱉甲煎丸長(zhǎng)期服用安全性,觀察其毒性反應(yīng)的靶器官及其損害的可逆性,筆者對(duì)其進(jìn)行了長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 受試藥物與試劑 鱉甲煎丸由武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供(批號(hào):100160),實(shí)驗(yàn)前用純化水配制成不同濃度的藥液,備用?？偟鞍?total protein,TP)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):101014)、清蛋白(albumin,ALB)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):101003)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):101101)、血清尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):101005)、肌酐(creatinine, Crea)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):101008),均由北京化工廠生產(chǎn)；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):100916),血糖(blood glucose,GlU)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):100925),總膽固醇(total cholesterol,TC)檢測(cè)試劑盒(批號(hào):101102),均由上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 儀器 Hematology Analyzer-Mek-5108kg型自動(dòng)檢測(cè)儀。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 純種SD大鼠,5～6周齡,體質(zhì)量(80±10)g,雌雄各半,購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物字第19-053號(hào),清潔(Ⅱ)級(jí)。實(shí)驗(yàn)前1周進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室,按正常供食(普通鼠飼料)、供水飼養(yǎng),室溫(25±2)℃,空氣濕度50%～65%,以適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2008-0009。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 取純種SD大鼠60只,隨機(jī)分為3組,每組20只,分別為對(duì)照組、鱉甲煎丸低劑量組(生藥5 g·kg-1,相當(dāng)于人用量的16.5倍)、鱉甲煎丸高劑量組(生藥10 g·kg-1,相當(dāng)于人用量的33.0倍)。對(duì)照組每只給予純化水2 mL灌服；鱉甲煎丸低、高劑量組分別灌服相應(yīng)劑量濃度的藥液,每只灌服體積為2 m L,并每周稱(chēng)大鼠體質(zhì)量,按大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量,以保證低、高劑量組的給藥劑量。各組每日以等體積給藥1次,連續(xù)給藥6個(gè)月。按觀察指標(biāo)中的要求檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)［4］。

1.2.2 大鼠一般狀況、體質(zhì)量及進(jìn)食量觀察 在用藥期間逐日觀察大鼠進(jìn)食量,外觀體征和行為活動(dòng),糞便性狀,每周稱(chēng)體質(zhì)量一次并觀察動(dòng)物皮毛。發(fā)現(xiàn)中毒反應(yīng)的動(dòng)物取出單籠飼養(yǎng),發(fā)現(xiàn)死亡或?yàn)l臨死亡動(dòng)物,及時(shí)尸檢。

1.2.3 血常規(guī)檢查 在實(shí)驗(yàn)中期(90 d)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束(180 d)和停藥14 d后,檢查血常規(guī),即外周血中的紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin,HB)含量測(cè)定、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類(lèi)。

1.2.4 血液生化學(xué)檢查 在實(shí)驗(yàn)中期與結(jié)束和停藥14 d后,分別取大鼠血樣測(cè)定TP、ALB、GLU、ALP、ALT、Crea、TC、BUN。

1.2.5 系統(tǒng)尸檢、臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),各組通過(guò)斷頸處死(尸檢前稱(chēng)體質(zhì)量)1/2的動(dòng)物,全面細(xì)致觀察動(dòng)物的腦、心、肝、肺、脾、腎、胃、腸、甲狀腺、腎上腺、睪丸、子宮、卵巢等主要臟器,并稱(chēng)各臟器質(zhì)量,計(jì)算動(dòng)物各臟器質(zhì)量與體質(zhì)量之比(臟器系數(shù))。另在各組動(dòng)物已處死作尸檢的基礎(chǔ)上,每組各取5只動(dòng)物的心、肝、腎、脾、肺、胃以10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(hematoxylineosinstaining,HE)染色,光鏡觀察組織學(xué)變化,并對(duì)各組的組織學(xué)變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理,判斷組間差異。

1.2.6 恢復(fù)性觀察 各組在停藥28 d后,對(duì)余下動(dòng)物作上述各項(xiàng)指標(biāo)檢查,對(duì)各主要臟器進(jìn)行尸檢與臟器系數(shù)測(cè)定,以觀察毒性反應(yīng)的可逆程度和可能出現(xiàn)的延遲毒性。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠一般狀況、體質(zhì)量及進(jìn)食量的影響 實(shí)驗(yàn)期間各組動(dòng)物毛色光滑、活動(dòng)自如、攝食、飲水、糞便均正常,生長(zhǎng)發(fā)育良好,未發(fā)現(xiàn)中毒現(xiàn)象。給藥前各組動(dòng)物體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥期間各組動(dòng)物體質(zhì)量逐周增加,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組之間的體質(zhì)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1,2。

2.2 對(duì)大鼠血常規(guī)及血液生化學(xué)指標(biāo)的影響 在不同時(shí)期檢查血常規(guī),各組之間的血常規(guī)、血液生化學(xué)指標(biāo)均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),并均在正常值范圍內(nèi)。結(jié)果見(jiàn)表3,4。

2.3 對(duì)大鼠臟器系數(shù)及組織病理學(xué)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束及停藥4周后各組動(dòng)物處死解剖,腦、心、肝、脾、肺、胃、腸、腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、附睪、卵巢、子宮等主要臟器的大小、形狀、顏色、質(zhì)地均正常,肉眼未發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)病變,各組臟器系數(shù)［g·(100 g)-1］均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。組織病理學(xué)觀察顯示,鱉甲煎丸低、高劑量組與對(duì)照組比較,給藥期被檢臟器組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)均未發(fā)現(xiàn)明顯由藥物引起的病理改變,恢復(fù)期后亦未發(fā)現(xiàn)明顯延遲毒性反應(yīng),提示鱉甲煎丸對(duì)大鼠主要臟器無(wú)明顯損害和毒性反應(yīng)。

表1 3組大鼠(雄性)實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of body weight am ong three groups of rats(male)during the experim ent g,±s

表1 3組大鼠(雄性)實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量比較Tab.1 Comparison of body weight am ong three groups of rats(male)during the experim ent g,±s

組別大鼠/只實(shí)驗(yàn)前第2周第4周第6周第8周第10周第12周鱉甲煎丸低劑量組20 84.5±3.9 106.4±7.4 119.7±7.6 136.8±7.9 157.4±9.5 186.5±19.8 221.6±23.4高劑量組20 86.3±4.6 104.5±5.7 120.5±8.5 137.7±7.9 158.4±11.7 181.2±21.5 220.4±22.5對(duì)照組20 85.4±3.8 102.5±6.3 118.5±7.5 138.6±8.9 158.6±10.5 185.5±22.1 224.3±25.1組別第14周第16周第18周第20周第22周第24周第28周鱉甲煎丸低劑量組249.7±23.5 263.5±23.9 276.4±33.3 286.5±37.6 296.7±37.9 320.1±35.5 359.4±43.4高劑量組249.1±21.3 259.3±24.1 274.3±35.7 280.5±29.5 301.1±36.9 318.3±31.7 351.5±51.4對(duì)照組253.6±24.7 267.6±26.3 271.5±31.5 280.4±32.9 308.4±35.6 325.4±31.4 354.7±54.6

表2 3組大鼠(雌性)實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量比較Tab.2 Comparison of body weight among th ree groups of rats(female)during the experim ent g,±s

表2 3組大鼠(雌性)實(shí)驗(yàn)期間的體質(zhì)量比較Tab.2 Comparison of body weight among th ree groups of rats(female)during the experim ent g,±s

組別大鼠/只實(shí)驗(yàn)前第2周第4周第6周第8周第10周第12周鱉甲煎丸低劑量組20 76.4±5.1 86.7±6.3 102.5±7.7 120.6±9.1 129.6±10.5 136.8±11.5 155.8±19.5高劑量組20 76.4±4.7 84.6±6.6 101.3±7.4 120.1±7.7 129.5±10.1 139.6±18.6 159.3±21.1對(duì)照組20 75.5±4.7 82.3±4.6 98.6±6.6 118.8±8.7 127.3±11.4 135.7±12.4 154.6±18.6組別第14周第16周第18周第20周第22周第24周第28周鱉甲煎丸低劑量組185.6±20.1 210.6±20.1 223.1±21.4 239.4±22.8 256.3±30.1 268.5±30.4 289.8±37.1高劑量組189.2±22.1 209.6±22.1 220.1±21.1 238.9±19.6 258.2±31.7 271.5±30.6 295.6±39.7對(duì)照組183.5±21.3 206.4±21.8 219.6±26.3 235.3±28.7 252.6±31.7 269.1±33.7 287.6±41.3

表3 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間紅細(xì)胞、白細(xì)胞、HB、多核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的變化Tab.3 Changes of red blood cells,white blood cells,HB,multinucleated cells and lym phocytes in three groups rats during the experiment ±s

表3 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間紅細(xì)胞、白細(xì)胞、HB、多核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的變化Tab.3 Changes of red blood cells,white blood cells,HB,multinucleated cells and lym phocytes in three groups rats during the experiment ±s

組別與時(shí)間大鼠/只紅細(xì)胞/ (×1012·L-1)白細(xì)胞/ (×109·L-1) HB/ (g·L-1)多核細(xì)胞/ %淋巴細(xì)胞/ %鱉甲煎丸低劑量組20給藥90 d 7.63±0.63 12.05±3.46 11.94±1.42 19.63±4.86 80.37±7.85給藥180 d 8.53±0.75 11.94±2.56 11.73±1.41 18.94±5.77 81.06±7.75停藥14 d 8.94±0.64 11.83±3.51 11.96±1.49 19.74±3.84 80.26±8.37鱉甲煎丸高劑量組20給藥90 d 7.51±0.55 12.06±2.42 12.64±1.95 20.76±4.98 79.24±8.73給藥180 d 8.28±0.36 11.41±3.75 11.65±1.72 19.52±5.32 80.48±9.32停藥14 d 8.51±0.55 12.69±4.02 12.28±1.21 19.56±3.85 80.44±8.33對(duì)照組20給藥90 d 7.84±0.54 11.64±2.45 12.47±1.25 20.68±5.64 79.32±8.35給藥180 d 8.45±0.68 12.83±3.45 11.65±1.31 19.79±4.86 80.21±8.63停藥14 d 8.46±0.74 12.54±4.15 12.06±1.63 19.12±4.24 80.88±9.37

表4 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間血液生化學(xué)指標(biāo)的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats during the experiment ±s

表4 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間血液生化學(xué)指標(biāo)的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats during the experiment ±s

組別與時(shí)間大鼠/只AST ALP (U·L-1) TP ALB (g·L-1)鱉甲煎丸低劑量組20給藥90 d 39.5±9.7 108.3±16.4 62.6±3.2 47.7±4.6給藥180 d 41.8±11.2 101.5±12.4 67.4±4.2 49.2±5.1停藥14 d 40.9±10.6 103.5±13.7 68.3±5.2 51.9±4.9鱉甲煎丸高劑量組20給藥90 d 40.8±12.7 113.7±17.3 68.5±4.7 44.7±5.3給藥180 d 41.7±11.3 107.3±12.4 66.9±4.7 47.3±4.2停藥14 d 40.1±10.3 102.4±10.4 66.2±4.9 52.1±4.7對(duì)照組20給藥90 d 41.3±12.5 110.6±18.5 66.4±4.1 46.3±3.6給藥180 d 40.6±11.4 103.4±11.4 65.7±3.9 48.2±4.1停藥14 d 41.5±10.4 100.8±14.5 66.3±4.4 51.1±5.6

續(xù)表4 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間血液生化學(xué)指標(biāo)的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats du ring the experiment ±s

續(xù)表4 3組大鼠實(shí)驗(yàn)期間血液生化學(xué)指標(biāo)的變化Tab.4 Changes of blood biochem istry in three groups rats du ring the experiment ±s

組別與時(shí)間GLU BUN TC (mmol·L-1) Crea/ (μmol·L-1)鱉甲煎丸低劑量組給藥90 d 5.3±0.6 8.3±0.6 2.4±0.6 56.2±7.3給藥180 d 5.3±0.5 8.0±0.6 2.2±0.4 54.6±6.8停藥14 d 5.2±0.5 8.7±0.6 2.3±0.4 55.6±6.6鱉甲煎丸高劑量組給藥90 d 5.1±0.5 8.3±0.6 2.4±0.6 53.5±5.7給藥180 d 5.2±0.5 8.3±0.6 2.3±0.3 56.7±6.1停藥14 d 5.2±0.5 8.2±0.6 2.2±0.4 58.4±7.3對(duì)照組給藥90 d 5.4±0.6 8.3±0.7 2.6±0.6 59.4±8.3給藥180 d 5.2±0.5 7.9±0.5 2.5±0.5 58.3±7.4停藥14 d 5.1±0.6 8.4±0.6 2.4±0.5 57.5±7.7

表5 3組大鼠主要臟器系數(shù)比較Tab.5 Comparison ofmain organ coefficient among three groups of rats ±s

表5 3組大鼠主要臟器系數(shù)比較Tab.5 Comparison ofmain organ coefficient among three groups of rats ±s

組別大鼠/只腦心肝脾肺腎睪丸(雄性)鱉甲煎丸低劑量組10 0.52±0.05 0.36±0.05 3.39±0.73 0.33±0.04 0.77±0.09 0.83±0.12 0.67±0.16高劑量組10 0.53±0.05 0.35±0.06 3.41±0.69 0.33±0.05 0.78±0.12 0.83±0.11 0.68±0.15對(duì)照組10 0.53±0.04 0.35±0.06 3.41±0.77 0.34±0.05 0.78±0.11 0.82±0.13 0.68±0.18組別附睪(雄性)卵巢(雌性)子宮(雌性)前列腺(雄性)腎上腺甲狀腺胸腺鱉甲煎丸低劑量組0.16±0.02 0.08±0.01 0.23±0.06 0.16±0.03 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00高劑量組0.15±0.02 0.08±0.01 0.24±0.05 0.16±0.03 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00對(duì)照組0.15±0.02 0.08±0.01 0.24±0.05 0.16±0.02 0.00±0.00 0.03±0.01 0.00±0.00

3 討論

鱉甲煎丸低、高劑量組(生藥5,10 g·kg-1,分別相當(dāng)于人用量的16.5倍和33.0倍)連續(xù)灌胃給藥180 d及停藥28 d,各劑量組雌、雄大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)正常,飲水、進(jìn)食量及一般狀況與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示鱉甲煎丸不影響大鼠生長(zhǎng)發(fā)育；鱉甲煎丸低、高劑量組的血常規(guī)及血液生化學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組比較均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示鱉甲煎丸不影響大鼠骨髓造血功能,對(duì)肝腎功能亦無(wú)損害,不影響肝對(duì)蛋白質(zhì)、糖的代謝和腎的排泄功能；主要臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢查均無(wú)明顯差異和異常變化,提示鱉甲煎丸對(duì)大鼠主要臟器質(zhì)量和臟器系數(shù)無(wú)明顯影響。

綜上所述,在本實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)大鼠連續(xù)灌胃給藥180 d及停藥28 d后,大鼠的一般狀況、體質(zhì)量變化、血常規(guī)、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)、組織病理學(xué)檢查均未見(jiàn)藥物引起的毒性反應(yīng)和延遲毒性反應(yīng),表明鱉甲煎丸對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠無(wú)明顯長(zhǎng)期毒性作用。提示大鼠連續(xù)灌胃鱉甲煎丸180 d的安全劑量為生藥10 g·kg-1(相當(dāng)于人用量的33.0倍)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.01.006

Long-term Toxicity Tests of Biejiajian Pills in Rats

XIONG Jing1,LIXia1,ZENG Fan-bo2,CHEN Peng1,ZHAILi1
(1.Wuhan Jianmin Pharmaceutical Groups Co.,Ltd.,Wuhan 430052,China;2.School of Pharmacy,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030 China)

Objective To study the long-term toxicity ofbiejiajianpills in rats,determine the safe dose,and provide reference for human use.MethodsSixty SD rats were divided into low,high dose groups,and control group,respectively (n=20 in each group),biejiajianpillswere orally administered to rats at the doses of5 and 10 g·kg-1daily for 6 months,while the control group was given with 2mLofdistilled water only.The general state,bodymass and food intakeweremeasured.By the end of the testand 4 weeks after drugwithdrawal,blood routine,hematologic and biochemical examination,organ coefficient,and histopathology were tested.ResultsCompared with the control group,no significant differences in all checked items were found in the treatment groups.ConclusionBiejiajianpills have a low long-term toxicity on the organs,blood routine, hematologic and biochemical indicators.The organ specific toxicity ofbiejiajianpills is not found.Biejiajianpill at tested doses is safe for oral use in rats.

Biejiajianpill;Toxicity,Long-term;Rats

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)01-0020-04

2012-08-01

2013-06-27

熊婧(1985-),女,湖北武漢人,助理工程師,主要從事中藥技術(shù)開(kāi)發(fā)工作。電話：027-84523351,E-mail：305836524@qq.com。

陳鵬(1978-),女,湖北武漢人,工程師,主要從事中藥新藥研發(fā)工作。電話：027-84514002,E-mail：610664040@qq.com。