高慧君，劉荔貞，白云峰，郭芳芳，馮 鋒,3?

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西太原030006；2.山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西臨汾041004；3.山西大同大學(xué)有機化學(xué)研究所，山西大同037009）

加蘭他敏（Galanthamine），又名尼瓦林、強肌寧、雪花胺(結(jié)構(gòu)式見圖1)，是從石蒜科植物中分離得到的一種異喹啉生物堿，具有較高的藥用價值。它是一種可逆性乙酰膽堿酯酶（AchE）抑制劑，臨床主要用于治療輕、中度阿爾茲海默?。ˋD，老年癡呆，具有較小的毒副作用和較好的治療效果。根據(jù)中國AD協(xié)會最新調(diào)查表明，全球有3 000多萬人患有老年癡呆，成為威脅人類健康的“四大殺手”之一，因此越來越多的人研究治療癡呆癥的藥物。加蘭他敏的氫溴酸鹽作為治療AD的藥物首先在奧地利獲得批準(zhǔn)，近年來又在美國、歐洲等陸續(xù)上市,而且它還在抗病毒、抗瘧疾、抗腫瘤、精神分裂癥輔助治療、慢性外傷性腦損傷的治療、面癱和偏癱等方面有著重要的作用。

圖1 氫溴酸加蘭他敏的結(jié)構(gòu)式

目前，加蘭他敏的分析方法主要有熒光法[1]、薄層色譜法[2]、放射免疫法[3]、核磁共振[4]和酶測定法[5]等。熒光法由于在測定波長下還可能會檢測到其他物質(zhì)，因此不能準(zhǔn)確定量；薄層色譜法靈敏度較低；免疫法和核磁共振價格貴。高效液相色譜法（HPLC）[6]和毛細(xì)管電泳法（CE）是現(xiàn)在使用較多的方法，可以直接進(jìn)行測定。但在測定中藥提取液或者生物樣品時，若樣品量較少則無法用HPLC測定，可用具有高效、高靈敏度、分析速度快、用樣量少等優(yōu)點的CE法測定。已有文獻(xiàn)中，研究的主要是非手性下的分離[7]、手性分離[8]或者結(jié)合質(zhì)譜[9]和柱后電化學(xué)發(fā)光[10]對石蒜中生物堿成分的測定。我們建立一種簡單、快捷的毛細(xì)管區(qū)帶電泳對藥物和生物樣品中的加蘭他敏進(jìn)行測定，為臨床試驗提供一種有效的方法。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

P/ACE System MDQ毛細(xì)管電泳儀，32 Karat software色譜工作站（美國Beckman公司）；B3200S超聲波清洗器（上海必能信超聲有限公司）；AP250D分析天平(美國Ohaus)；未涂層石英毛細(xì)管，內(nèi)徑75 μm，總長度57 cm，有效長度50 cm（河北永年銳灃色譜器件有限公司）；HH-42型數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱（常州國華電器有限公司）；TFL-16C型高速電動離心機（菏澤石油化工學(xué)校儀器設(shè)備廠）；PSH-2C型酸度計（上海大普儀器有限公司）。

氫溴酸加蘭他敏對照品（上海阿拉丁試劑有限公司），磷酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），磷酸二氫鈉（分析純，天津市化學(xué)試劑六廠），三氯乙酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠），氫溴酸加蘭他敏注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司），甲醇（色譜純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司），正常人血清由山西大同大學(xué)附屬醫(yī)院提供。

1.2 溶液的配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取適量的氫溴酸加蘭他敏對照品，用二次蒸餾水稀釋，分別配制成0.015，0.029，0.059，0.082 ，0.110，0.128，0.160 mg/mL 系列濃度的對照標(biāo)準(zhǔn)液。所有溶液用0.22 μm的微孔濾膜（水系）過濾，并進(jìn)行超聲處理，置于冰箱中4℃保存。

1.2.2 藥物樣品溶液的配制

取適量氫溴酸加蘭他敏注射液稀釋，用0.22 μm的微孔濾膜（水系）過濾，并進(jìn)行超聲處理，置于冰箱中4℃保存。

1.2.3 生物樣品溶液的配制

取適量去激素的人體血清，加入一定量10%三氯乙酸，保證蛋白質(zhì)完全沉淀，10 000 r/min離心10 min，移取上清液并加入適量氫溴酸加蘭他敏對照品，震蕩搖勻，在真空干燥箱干燥，過濾后進(jìn)樣分析。

1.3 電泳操作條件

新的未涂層石英毛細(xì)管，需要先進(jìn)行活化處理，沖洗方法是：在20 psi條件下，分別使用甲醇5 min，H2O 5 min，0.1 mol/L HCl 5 min，H2O 5 min，0.1 mol/L NaOH 30 min，H2O 5 min，運行電解質(zhì)20 min。兩次運行之間，用0.1 mol/L NaOH 2 min，H2O 1 min，運行電解質(zhì)2 min。檢測波長289 nm，壓力進(jìn)樣0.5 psi，0.5 s，運行電壓15 kV，溫度25℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫溴酸加蘭他敏的紫外吸收光譜

用二極管陣列檢測器在線檢測對照品氫溴酸加蘭他敏在緩沖溶液中的光譜，確定氫溴酸加蘭他敏在289 nm處有最大吸收，故選擇檢測波長為289 nm。

2.2 電泳分離條件的選擇

2.2.1 緩沖體系的選擇

本實驗分別考察了硼砂-硼酸、磷酸鹽溶液為背景電解質(zhì)的分離效果。背景電解質(zhì)不僅可以改變毛細(xì)管內(nèi)壁表面電勢，而且影響溶液的濃度和被測物的擴(kuò)散系數(shù)，從而會使樣品組分的分離效果和遷移時間發(fā)生改變。結(jié)果表明，在磷酸-磷酸鹽的緩沖體系下，遷移時間較快，峰形好，分離度高，分離效果較理想。

2.2.2 緩沖溶液濃度的選擇

本實驗在固定pH為2.5的條件下，又分別以（A）20 mmol/L、(B)40 mmol/L、(C)50 mmol/L、(D)60 mmol/L、(E)80 mmol/L的NaH2PO4-H3PO4為背景電解質(zhì)進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖2。隨著濃度的增大，遷移時間也隨著增大。濃度越大，產(chǎn)生電流越大熱量越高，濃度的降低，則會導(dǎo)致峰形變寬，變差，分離效果變差。因此，選擇50 mmol/L為最佳濃度，在這個條件下峰形較好，而且分析時間也較快。

圖2 緩沖溶液濃度對分析物分離的影響

2.2.3 緩沖溶液pH的選擇

運行緩沖液pH的選擇是又一個優(yōu)化分離效果的重要考察因素,它能改變電滲流的大小，酸度越低，電滲流越小，進(jìn)而影響遷移時間及樣品的解離，從而影響分離的選擇性和靈敏度。在固定濃度為50 mmol/L的條件下分別對pH為 (A)4.0、(B)3.5,(C)3.0,(D)2.5,(E)2.1 進(jìn)行了考察，結(jié)果如圖 3。隨著pH的增加，遷移時間只是稍有增加。pH≥3.0時，隨著pH的增加，峰形也會變寬，稍有拖尾現(xiàn)象。在pH為2.5和2.1時，遷移時間并未發(fā)生改變，可能是在pH為2.5時，被分析物與背景電解質(zhì)溶液中的氫離子結(jié)合達(dá)到平衡飽和狀態(tài)。因此，本實驗選擇pH=2.5為最佳的酸度條件。

圖3 緩沖溶液pH對分析物分離的影響

2.2.4 運行電壓的選擇

工作電壓的選擇，雖然對分離效果影響不是非常大，但是會影響分析時間，因此也作為一個考察因素。一般情況下，電壓越高，遷移時間越快,分析時間縮短，峰形變尖，這是由于電滲流的增加所致，電滲流的遷移速度快于溶質(zhì)的電泳速度。但是電壓過高，又會產(chǎn)生較大的電流和較高的熱量，反而會使分離效果變差。本實驗在固定pH為2.5，緩沖液的濃度為50 mmol/L的條件下，分別對電壓為(A)23 kV，(B)20 kV，(C)15 kV，(D)12 kV進(jìn)行了考察,結(jié)果見圖4。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與最低檢出限

在優(yōu)化的電泳條件下，對一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析測定，用分析物的峰面積（Y）與分析物的濃度（X）做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示其有較好的線性關(guān)系。依據(jù)3倍信噪比來確定其最低檢出限。得到的線性方程Y=409 424x+5 312.8，r=0.998 9,線性范圍 0.015 ～ 0.160 mg/mL,最低檢出限 2.57×10-5mg/mL。

2.4 精密度與重現(xiàn)性試驗

將供試品溶液配制成3種不同濃度的樣品，連續(xù)進(jìn)樣分別測定3次，結(jié)果日內(nèi)遷移時間和峰面積變異系數(shù)分別為 0.10%～0.22%,0.13%～1.10%。將上面的樣品放置在4℃條件下恒溫保存，每天均重復(fù)測定3次，共測定3 d，結(jié)果日間遷移時間和峰面積變異系數(shù)分別為 0.14%～0.34%,0.76%～1.63%。實驗結(jié)果表明，本方法具有較好的精密度和重復(fù)性。

圖4 電壓對分析物分離的影響

2.5 加樣回收實驗

在供試品溶液中加入3種不同濃度的氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的回收率結(jié)果見表2。

在處理好的人血清樣品中加入3種不同濃度的氫溴酸加蘭他敏標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的回收率結(jié)果見表1。在血清中測得的氫溴酸加蘭他敏電泳圖如圖5。

表1 加樣回收實驗及樣品含量測定結(jié)果

2.6 實際樣品含量的測定

精密稱取批號為的氫溴酸加蘭他敏注射液，置于10 mL容量瓶中，超聲并定容至刻度，搖勻。進(jìn)樣分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算含量，結(jié)果：藥品批號110801，含量(n=5)0.522 4，0.525 1，0.510 5，0.501 1，0.499 3 mg/g，平均0.511 7 mg/g，RSD=2.32。電泳圖見圖6。

圖5 血清中氫溴酸加蘭他敏的電泳圖

圖6 氫溴酸加蘭他敏注射液的電泳圖

3 結(jié)論

本實驗采用毛細(xì)管電泳法測定氫溴酸加蘭他敏含量，對不同的實驗條件和電泳條件進(jìn)行了詳細(xì)地分析與優(yōu)化選擇，經(jīng)大量試驗得出所建立的方法重現(xiàn)性、精密度和回收率均較好的方法，且成本較低，靈敏度較高，用量小，分析速度快，而且在生物樣品中測定的結(jié)果也較好，為臨床的測定提供可能性的方法。

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