許欣婷，董明清，胡美，徐敦全，李志超，吳昌歸△

(第四軍醫(yī)大學(xué)1西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2病理和病理生理教研室，陜西西安 710038)

骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷*

許欣婷1，董明清2，胡美1，徐敦全2，李志超2，吳昌歸1△

(第四軍醫(yī)大學(xué)1西京醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2病理和病理生理教研室，陜西西安 710038)

目的:觀察經(jīng)尾靜脈輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液(MSCs CdM)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的治療作用及其機(jī)制。方法：采用全骨髓培養(yǎng)法分離純化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，傳至第3代時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，并且收集上清液用超濾離心管進(jìn)行離心。30只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS模型組和MSCs CdM治療組。對(duì)照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水(0.01 mL/g)，LPS組和MSCs CdM治療組腹腔內(nèi)注射LPS(5 mg/kg，0.01 mL/g)制備急性肺損傷模型。造模1 h后經(jīng)尾靜脈輸注MSCs CdM(MSCs CdM治療組)或生理鹽水(LPS組或?qū)φ战M)300 μL。6 h后處死小鼠，留取標(biāo)本檢測(cè)肺組織病理形態(tài)學(xué)、肺組織濕干重比(W/D)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量、血清及BALF中細(xì)胞因子水平和肺組織中髓過(guò)氧化物酶(MPO)的活性。結(jié)果:與對(duì)照組比較，LPS處理后肺組織病理?yè)p傷嚴(yán)重，BALF中蛋白、血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素6(IL-6)含量、肺組織中MPO活性及肺組織濕干重比均顯著升高。與LPS組比較，MSCs CdM治療組肺組織病理?yè)p傷程度減輕，BALF中蛋白、血清TNF-α和IL-6含量、肺組織中MPO活性及肺組織濕干重比均顯著降低，而B(niǎo)ALF中白細(xì)胞介素10(IL-10)和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)水平顯著高于LPS組和對(duì)照組。結(jié)論:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)上清液可有效減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)肺部TNF-α、IL-6、IL-10和KGF的水平有關(guān)。

急性肺損傷;角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子;脂多糖類(lèi);間充質(zhì)干細(xì)胞

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是肺內(nèi)外多種致病因素導(dǎo)致的肺泡和毛細(xì)血管膜彌漫性損傷、肺組織充血、水腫的急性病理過(guò)程，發(fā)展至嚴(yán)重階段為急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ARDS嚴(yán)重影響肺臟氣體交換功能，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和頑固低氧血癥，死亡率高達(dá)40%以上［1］。其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為，炎癥反應(yīng)-抗炎反應(yīng)失衡是ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展最重要的病理生理機(jī)制［2］。近年來(lái)對(duì)ALI/ ARDS的治療藥物和措施進(jìn)行了大量研究，業(yè)已證實(shí)呼吸支持治療仍是當(dāng)前的主要救治手段，治療藥物的研究尚未取得突破性進(jìn)展。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是一類(lèi)具有不同的自我更新能力和多向分化潛能的未分化細(xì)胞，歸巢到肺臟損傷部位后可分化為肺內(nèi)多種細(xì)胞參與修復(fù)［3］。無(wú)論是氣管內(nèi)滴注MSCs還是外源性輸入MSCs都可以減輕脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)導(dǎo)致的小鼠肺損傷［4-5］。MSCs治療ALI在動(dòng)物模型中取得了理想的效果，但是其機(jī)制尚未完全明確。MSCs作為全細(xì)胞療法治療肺損傷對(duì)于病人可能存在一些風(fēng)險(xiǎn)［6-7］，因此探討其培養(yǎng)上清液(MSCs-conditioned medium，MSCs CdM)是否具有同樣治療作用是很有意義的工作［8］。本研究利用LPS誘導(dǎo)肺損傷小鼠模型，觀察了MSCs CdM對(duì)肺損傷的治療作用并初步探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要儀器及試劑

LPS(O55:B5)，顯微鏡(Olympus)，離心機(jī)(Herus)，髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性試劑盒(南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所)，超濾離心管(Millipore Amicon Ultra-15，3 000 Da)，酶標(biāo)儀(Tecan)。

2 方法

2.1 MSCs分離、鑒定和培養(yǎng)斷頸處死BALB/c小鼠后于75%乙醇中浸泡5 min，移入超凈臺(tái)，取出雙下肢股骨及脛骨，眼科剪剪去股骨及脛骨骨髁，用PBS液反復(fù)沖洗骨髓腔3次，收集骨髓。將獲得的骨髓細(xì)胞懸浮液移入離心管，以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用DMEM-LG培養(yǎng)液(10%FBS，100 U/L青霉素，100 U/L鏈霉素)重懸，接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)第2天換液1次，去除未貼壁細(xì)胞，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征。以后每3 d換液1次。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底約80%時(shí)，用0.25%含 EDTA胰蛋白酶室溫消化1 min，按1∶2傳代培養(yǎng)。留取第3代、第4代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)鑒定。

2.2 MSCs培養(yǎng)上清液的收集每次換液時(shí)收集MSCs上清液于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄掉細(xì)胞碎渣和死細(xì)胞，將獲得的上清倒入超濾離心管中離心(4℃、3 000×g，2 h)。收集超濾液體，置4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 動(dòng)物模型制備健康、雄性清潔級(jí)BALB/c小鼠30只，體重18～22 g，8～10周，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)同意。小鼠隨機(jī)均分為3組，每組各10只，即對(duì)照組、LPS組和MSCs CdM治療組。對(duì)照組腹腔內(nèi)注射0.01 mL/g生理鹽水，LPS組和MSCs CdM治療組腹腔內(nèi)注射LPS(5 mg/kg，0.01 mL/g)制備急性肺損傷模型。造模30 min后經(jīng)尾靜脈輸注MSCs CdM(MSCs CdM治療組)或生理鹽水(LPS組或?qū)φ战M)300 μL，6 h后麻醉后處死小鼠，留取肺組織標(biāo)本作各種檢測(cè)用。

2.4 肺組織病理檢測(cè)放血處死動(dòng)物，取出左肺的一葉肺組織迅速放入4%多聚甲醛中4℃固定24～48 h，取出后置于70%乙醇溶液中，標(biāo)本取全后，進(jìn)行石蠟包埋。制作5 μm厚的切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)改變。

2.5 肺水腫參數(shù)測(cè)定小鼠放血處死后迅速分離右肺，用吸水紙吸干表面水分和血液，電子天平稱(chēng)量肺濕重，57℃烤箱內(nèi)將肺烘干至質(zhì)量衡重(72 h)。計(jì)算得出肺濕干重比(wet/dry weight ratio，W/D)。此可反映肺水腫程度。

2.6 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中蛋白、角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor，KGF)和白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)含量測(cè)定用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，固定于恒溫手術(shù)架上，放血處死動(dòng)物，剪開(kāi)頸部皮膚，鈍性分離暴露器官并剪一倒“V”字型切口，進(jìn)行氣管內(nèi)插管，用4℃PBS灌洗液灌洗肺并回收BALF，每次1 mL(反復(fù)灌洗3次后抽出)，共4次，回收率約90%(約3.6 mL)。用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。BALF在450×g離心10 min，上清收集后用于測(cè)定細(xì)胞因子。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，顯色后酶標(biāo)儀讀數(shù)并記錄結(jié)果。

2.7 血清中IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的表達(dá)用小鑷子剔除小鼠眼球，收集血液，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，顯色后酶標(biāo)儀讀數(shù)。

2.8 肺組織勻漿的制備與髓過(guò)氧化物酶(myeloper-oxidase，MPO)活性測(cè)定迅速分離全肺(n=8)，電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取組織重量。迅速將組織轉(zhuǎn)移到冰盒上，以試劑盒提供的試劑為勻漿介質(zhì)，按重量體積比1∶19加勻漿介質(zhì)。用眼科小剪盡快剪碎組織后充分勻漿，制備成5%的組織勻漿并按照試劑盒步驟檢測(cè)MPO活性。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 肺組織病理學(xué)變化

光鏡下見(jiàn)對(duì)照組和MSCs CdM組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔及支氣管腔未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞及滲出物，可見(jiàn)少許紅細(xì)胞(圖1A、C)。LPS組鏡下可見(jiàn)肺組織水腫，點(diǎn)、片狀出血，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔變窄，局灶性肺不張和肺氣腫(圖1B)。

Figure 1.HE staining of mouse lung tissues.A:control group;B:LPS group;C:LPS+MSCs CdM group.圖1 各組小鼠肺組織病理變化

2 W/D變化

對(duì)照組的右肺W/D與MSCs CdM組之間無(wú)明顯差別。LPS組右肺W/D與對(duì)照組相比較明顯增加(P＜0.01);而MSCs CdM組與LPS組相比右肺W/D顯著減少(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

3 支氣管肺泡灌洗液蛋白含量的變化

LPS顯著增加BALF中蛋白含量，表明肺通透性增加，導(dǎo)致血液中蛋白漏出增多;而在MSCs CdM組BALF中蛋白含量明顯減少，與LPS組相比有顯著差別，見(jiàn)圖3。

4 MSCs CdM對(duì)LPS導(dǎo)致的小鼠肺MPO活力的影響

對(duì)照組與MSCs CdM治療組小鼠肺組織勻漿中MPO活力無(wú)明顯差別;LPS組中MPO活力明顯增加，見(jiàn)圖4。

Figure 3.The changes of protein level in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)in mice.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖3 BALF中蛋白含量的變化

Figure 4.The changes of MPO activity in the lung of mice.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs LPS.圖4 小鼠肺組織中MPO活性的變化

5 小鼠血液中IL-6及TNF-α的變化

與對(duì)照組和MSCs CdM治療組相比，LPS損傷6 h后IL-6和TNF-α水平顯著增高;在對(duì)照組和MSCs CdM治療組間上述因子無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The concentrations of TNF-α and IL-6 in serum of mice.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS.圖5 小鼠血清IL-6和TNF-α變化

6 支氣管肺泡灌洗液中KGF及IL-10含量

與對(duì)照組相比，LPS組和MSCs CdM治療組KGF和IL-10顯著增高;而MSCs CdM治療組明顯高于LPS組，見(jiàn)圖6。

Figure 6.The concentrations of IL-10 and KGF in BALF of mice.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs LPS.圖6 小鼠BALF中IL-10及KGF變化

討論

LPS是革蘭陰性桿菌外膜的主要成分，引起炎癥反應(yīng)、休克甚至死亡。當(dāng)LPS攻擊肺部時(shí)，LPS可以造成肺泡毛細(xì)血管膜損害，導(dǎo)致多形核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)附著、激活與積壓，引起肺組織炎癥反應(yīng)、肺出血和肺水腫等，繼而影響氣體交換并最終導(dǎo)致呼吸衰竭。肺組織中MPO 是PMN嗜天青顆粒釋放的過(guò)氧化物酶類(lèi)，其活性可作為PMN浸潤(rùn)的證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MSC-CdM能顯著減輕肺組織炎癥滲出，降低肺水腫參數(shù)(W/D)、BALF中蛋白含量及肺組織MPO活性，提示輸入MSC-CdM能夠減輕脂多糖致急性肺損傷程度，這結(jié)果與Zhu等［9］的研究一致。

ALI/ARDS的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明了。在膿毒癥合并ALI/ARDS中，LPS是一重要介質(zhì)，它通過(guò)激活NF-κB等多種轉(zhuǎn)錄因子，并與TNF-α 和IL-6等致炎因子基因啟動(dòng)子區(qū)反應(yīng)元件結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，TNF-α和IL-6合成增多，導(dǎo)致組織損傷和結(jié)構(gòu)破壞［10］。我們的實(shí)驗(yàn)表明MSCs CdM處理后可明顯降低BALF中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6水平?，F(xiàn)已公認(rèn)ALI是一種介質(zhì)病，內(nèi)源性細(xì)胞因子在疾病的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用。除促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等)外，抗炎細(xì)胞因子(IL-1ra、sTNF-R、IL-4、IL-10、TGF等)的表達(dá)受抑會(huì)加重組織損傷程度。有研究證實(shí)，LPS即可誘生大量的炎癥介質(zhì)，也使抑炎因子IL-10分泌下降，使TNF-α/IL-10平衡失調(diào)［11］。我們的研究表明，MSCs CdM處理可有效提升肺組織IL-10水平，恢復(fù)TNF-α/IL-10平衡。這可能是MSCs CdM治療ALI/ARDS的又一機(jī)制。

KGF是介導(dǎo)間質(zhì)與上皮之間相互作用的一種生長(zhǎng)因子，可以特異性地促進(jìn)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞增殖和分化。Curley等［12］在研究呼吸機(jī)造成的肺損傷模型中發(fā)現(xiàn)MSCs CdM通過(guò)旁分泌KGF機(jī)制減輕肺損傷。在我們的實(shí)驗(yàn)中也觀察到:MSCs CdM尾靜脈注射可使LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型BALF中KGF明顯增高，推測(cè)MSCs CdM會(huì)因此促進(jìn)組織的修復(fù)進(jìn)程，加快疾病恢復(fù)。但這一因子的增多是否與ALI/ ARDS后的肺纖維化形成相關(guān)仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了MSCs CdM能有效減輕LPS誘發(fā)ALI/ARDS小鼠模型的肺損傷程度，這可能與其抑制TNF-α、IL-6等致炎因子合成和上調(diào)抑炎因子IL-10等的表達(dá)相關(guān)。此外，MSCs CdM還能上調(diào)肺組織中KGF的含量，將有利于組織修復(fù)。

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Bone marrow-derived mesenchymal stem cell-conditioned medium attenuates LPS-induced acute lung injury in mice

XU Xin-ting1，DONG Ming-qing2，HU Mei1，XU Dun-quan2，LI Zhi-chao2，WU Changgui1
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，Xijing Hospital，2Department of Pathology and Physiopathology，F(xiàn)ourth Military Medical University，Xi’an 710038，China.E-mail:changgui@fmmu.edu.cn)

AIM:To explore the effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells-conditioned medium (MSCs CdM)on lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury.METHODS:Lung injury was induced in mice by intraperitoneal injection of LPS.The mice were given a tail vein injection of MSCs CdM or normal saline 1 h after LPS administration.The mice were killed by an intraperitoneal injection of pentobarbital 6 h after LPS injection for either bronchoalveolar lavage fluid(BALF)and serum collection or lung histological analysis.RESULTS:Compared with control group，the BALF levels of protein，interleukin-10(IL-10)and keratinocyte growth factor(KGF)，the serum levels of tumor necrosis factor α(TNF-α)and IL-6，and the myeloperoxidase(MOP)activity in the lung tissues were significantly higher in LPS group，and severe pathological damages in the lung tissues were also observed.Treatment with MSCs CdM significantly reduced the BALF prtein level，the seum TNF-α and IL-6 levels and the lung MPO activity，and attenuated the lung pathological damages，but further increased the levels of IL-10 and KGF in the BALF.CONCLUSION:Treatment with MSCs CdM attenuates the lung injuries induced by LPS，which may be via regulating the expression of TNF-α，IL-6，IL-10 and KGF.

Acute lung injury;Keratinocyte growth factor;Lipopolysaccharides;Mesenchymal stem cells

R363.2+2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.016

1000-4718(2014)02-0286-05

2013-09-27

2013-12-05

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81072642;No.81372129)

△通訊作者Tel:029-84771687;E-mail:changgui@fmmu.edu.cn