邢永華，孟愛(ài)民

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所、天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300192；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，青海西寧 810001）

近現(xiàn)代生物分析技術(shù)手段的革新推動(dòng)著生物學(xué)的發(fā)展，亦決定著人們對(duì)生命現(xiàn)象及其規(guī)律的認(rèn)識(shí)程度，由于過(guò)去技術(shù)水平的限制，“還原論”成為生物、醫(yī)學(xué)及藥物等研究的指導(dǎo)思想，其強(qiáng)調(diào)一類疾病，一種靶標(biāo)，單一靶向藥物治療和藥效預(yù)測(cè)的模式，主觀割裂了生命現(xiàn)象間的相互協(xié)調(diào)、相互適應(yīng)、相互影響的復(fù)雜聯(lián)系，因此，闡明疾病、生物靶標(biāo)與藥物三者間關(guān)系時(shí)，“還原論”則顯得過(guò)于簡(jiǎn)單和武斷［1］。

近些年，高通量分析技術(shù)的出現(xiàn)，使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子間相互協(xié)調(diào)變化關(guān)系的研究成為可能，并推動(dòng)著生物學(xué)研究從細(xì)胞水平上升至系統(tǒng)水平。單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)譜分析（single cell network profiling，SCNP）屬于高通量分析手段之一，它是研究復(fù)雜組織（血液、骨髓等）內(nèi)，細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)“節(jié)點(diǎn)”（蛋白）表達(dá)水平及“節(jié)點(diǎn)”間網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)關(guān)系的方法，其在分析疾病進(jìn)程、預(yù)測(cè)疾病結(jié)局、藥物篩選及個(gè)體化治療方面顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用甚為廣泛?，F(xiàn)就SCNP的原理及其應(yīng)用做一綜述。

1 SCNP

1．1 SCNP的概念 SCNP技術(shù)是利用多參數(shù)（同時(shí)檢測(cè)≥5個(gè)標(biāo)記物）流式細(xì)胞術(shù)，在靜止或應(yīng)激狀態(tài)下同時(shí)檢測(cè)復(fù)雜組織（腫瘤、血液、骨髓）、不同類型（亞群）細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白表達(dá)水平，通過(guò)高通量數(shù)據(jù)分析方法描述各通路蛋白之間的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)關(guān)系，勾勒出信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜。由于不同條件下（應(yīng)激、病理、治療）基因、染色體、表觀遺傳分子的改變，最終將集中體現(xiàn)于細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白變化［2］，因此，細(xì)胞水平上的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜能夠全面地描述細(xì)胞所處狀態(tài)（增殖、衰老、細(xì)胞周期、磷酸化水平、死亡、凋亡），可為疾病機(jī)制的研究、診斷、治療及藥物開(kāi)發(fā)提供更深刻、精確的信息。

通常的做法是，利用多參數(shù)流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)正常、異常細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白表達(dá)水平，并將兩種細(xì)胞的節(jié)點(diǎn)蛋白水平進(jìn)行對(duì)比、關(guān)聯(lián)分析，即可確定異常細(xì)胞的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜的特征。該網(wǎng)絡(luò)譜可分析異常信號(hào)通路與病程、藥物間的關(guān)系；并且結(jié)合不同信號(hào)通路所控制的細(xì)胞行為（轉(zhuǎn)移、增殖、凋亡、分化、衰老），還可預(yù)測(cè)細(xì)胞的最終結(jié)局；亦有助于發(fā)現(xiàn)可能成為新藥物靶標(biāo)的節(jié)點(diǎn)蛋白［3］。

1．2 SCNP技術(shù)特征 當(dāng)結(jié)合有不同的抗體標(biāo)記的細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀，后者可分辨出多種細(xì)胞類型及檢測(cè)不同信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白的表達(dá)水平和修飾狀態(tài)［4］，在單細(xì)胞水平上即可獲得信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜，因此有人認(rèn)為SCNP是一項(xiàng)研究細(xì)胞信號(hào)通路生物學(xué)技術(shù)。其特征包括：平臺(tái)低（多參數(shù)流式細(xì)胞儀）、快速分析（每秒可分析成千上萬(wàn)的細(xì)胞）、高通量（細(xì)胞類型多、信號(hào)通路多、節(jié)點(diǎn)蛋白多）、多維度（數(shù)據(jù)具有多維度特征）。

1.2.1 細(xì)胞處理 SCNP主要分析懸浮狀態(tài)細(xì)胞，研究報(bào)道集中于癌癥［白血病（AML）［5］、膀胱癌［6］］與自身免疫性疾?。巯到y(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）［7］、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）［8］］等。體外實(shí)驗(yàn)常用骨髓細(xì)胞、造血干細(xì)胞、外周血單個(gè)核細(xì)胞、全血細(xì)胞、脾細(xì)胞等。目前對(duì)實(shí)體性腫瘤（前列腺癌、胃癌、子宮癌）分析的嘗試亦有報(bào)道［9-11］。

處理流程包括，首先以固定劑固定不同類型的細(xì)胞（無(wú)需事先分離），其后，以破膜劑提高細(xì)胞膜通透性，最后抗體標(biāo)記細(xì)胞分型蛋白（細(xì)胞表面標(biāo)志蛋白）及節(jié)點(diǎn)蛋白（胞內(nèi)蛋白）（Fig 1）?？梢?jiàn)，SCNP技術(shù)的高通量特征僅對(duì)固定過(guò)的細(xì)胞而言。

1.2.2 細(xì)胞標(biāo)記 各種熒光素可在不同光源激發(fā)下，產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的光（熒光素發(fā)射光光譜），可被流式細(xì)胞儀的掃描裝置檢測(cè)，在顯示屏上完成細(xì)胞分群和節(jié)點(diǎn)蛋白所處狀態(tài)的分析。熒光素開(kāi)發(fā)是流式技術(shù)繼硬件設(shè)備（激發(fā)光光源、光柵等）之后發(fā)展最為迅速的。熒光素的發(fā)射光譜目前已覆蓋整個(gè)可見(jiàn)光光譜。常見(jiàn)的熒光素有藻紅蛋白（PE）、別藻藍(lán)蛋白（APC）、異硫氰酸熒光素（FITC）、多甲藻葉綠素蛋白（PerCP）等30多種（Tab 1）。SCNP技術(shù)中，限制檢測(cè)標(biāo)記物數(shù)量的因素包括熒光素、儀器硬件、數(shù)據(jù)分析軟件，目前，同時(shí)測(cè)量18種不同標(biāo)記物是傳統(tǒng)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)的上限［13］。值得提出的是，CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的出現(xiàn)，加快了熒光標(biāo)記時(shí)代的結(jié)束，其以過(guò)渡金屬（鑭）制作的金屬抗體代替熒光素抗體標(biāo)記，使得同時(shí)檢測(cè)的標(biāo)記物數(shù)目增至42個(gè)（理論上可超過(guò)100），并且消除了背景值影響，減少了檢測(cè)通道間的信號(hào)干擾，檢測(cè)通道數(shù)量可達(dá)上百個(gè)，可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)譜的精細(xì)分析［14］。

Tab 1 Common laser and fluorochromes used in flow cytometry［15］

在SCNP分析技術(shù)中，按照蛋白標(biāo)記相對(duì)于細(xì)胞膜的位置，可分為，細(xì)胞分型蛋白標(biāo)記（表面蛋白）與信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白（胞內(nèi)蛋白）標(biāo)記。后者是SCNP技術(shù)檢測(cè)分析的主要對(duì)象，其可提供疾病機(jī)制、結(jié)局預(yù)測(cè)、藥物開(kāi)發(fā)、療效評(píng)估等重要信息。因此，抗體與節(jié)點(diǎn)蛋白的特異性親和力，是降低假陽(yáng)性和假陰性誤差的關(guān)鍵。

隨著單克隆抗體和激光光源的應(yīng)用，流式細(xì)胞技術(shù)的細(xì)胞純化和細(xì)胞分型能力有了很大提高。目前已經(jīng)應(yīng)用于血液系統(tǒng)疾病、細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)、淋巴瘤、白血病等研究，以血液及骨髓細(xì)胞（亞群）表面標(biāo)志蛋白研究尤深入，例如“造血干祖細(xì)胞”（hematopoietic stem cells，HSCs）表面標(biāo)志 Lin-（L）c-Kit+ （K）Sca-1+ （S）［16］；淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志 CD45、CD34、CD11b、CD15、TCR、BCR；干細(xì)胞樣記憶 CD8+細(xì)胞表面標(biāo)志CD161++IL-18Rα+［17］；干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞（TSCMs）表面標(biāo)志CD3+CD8+CD45RO-CCR7+CD45RA+CD62L+CD27+CD28+IL7Rα+CD95+［18］。表面標(biāo)志不僅能夠幫助區(qū)分細(xì)胞類型、異常細(xì)胞，還可反映出細(xì)胞生長(zhǎng)、分化階段。目前，新型的CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀的電感偶合等離子體（inductively coupled plasma，ICP）替代了廣泛被使用的激光光源［14］，結(jié)合金屬抗體標(biāo)記，CyTOF分析精密程度得到極大提高，有利于細(xì)化細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)更多數(shù)量極少而生物學(xué)作用極為重要的細(xì)胞群。

Fig 1 Workflow SCNP by flow cytometry［12］① Incubate cells accompanying stimulators；② Cells are fixed and permeabilized；③ Cellsand nodes are stained with a cocktail ofmonoclonal antibodies；④ The fluorescent signals are detected with flow cytometry

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 SCNP的多維數(shù)據(jù)分析過(guò)程，一般包括數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、可視化、關(guān)聯(lián)分析。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，目的是去除背景值或噪音值的影響，反映出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)變化。通常做法是將數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化（熒光數(shù)值分布通常呈現(xiàn)對(duì)數(shù)正態(tài)分布）。例如，估計(jì)細(xì)胞在靜止?fàn)顟B(tài)下的平均熒光信號(hào)強(qiáng)度（themedian fluorescent intensity，MFI），basal＝分辨信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白的反應(yīng)性和誘導(dǎo)性強(qiáng)弱，fold＝所有激活的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)蛋白的信號(hào)強(qiáng)度，Total＝數(shù)據(jù)可視化處理，以散點(diǎn)圖、條圖、餅圖、線圖等較為常用。多色圖（熱圖）常用于高通量數(shù)據(jù)可視化，通常用紅色、綠色和藍(lán)色（包括上述3種顏色的深淺變化）來(lái)顯示蛋白表達(dá)的高低，此時(shí)通常的二維圖像變成了五維［19］，能顯示節(jié)點(diǎn)蛋白間的變化關(guān)系；關(guān)聯(lián)分析則可以揭示不同細(xì)胞類型與疾病或免疫水平間的關(guān)系。包含了主成份分析和聚類分析模型的多款軟件已經(jīng)開(kāi)發(fā)使用，不同分析模型各有所長(zhǎng)。例如，高斯混合模型分析能夠避免聚類分析過(guò)程中分類個(gè)數(shù)必須主觀指定的缺陷；Boolean算法能夠幫助研究者將不同標(biāo)記的蛋白表型任意組合，有利于發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞亞型；FlowType工具則可分析若干細(xì)胞表型與疾病結(jié)果的關(guān)聯(lián)性，對(duì)多重統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可自動(dòng)校正［20-21］，可挑選與疾病結(jié)果關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的，具有代表性的細(xì)胞或蛋白表型，有助于疾病結(jié)局的預(yù)測(cè)以及設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)單、有效的免疫分型方案；SPADE（spanning-tree progression analysis of densitynormalized events，SPADE）［22］則可直觀區(qū)分細(xì)胞類型及其轉(zhuǎn)化，甚至是細(xì)胞成分變化或細(xì)胞分化不同階段的蛋白表達(dá)譜，還提供關(guān)于信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)間的反饋調(diào)節(jié)等信息。

2 SCNP在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

SCNP技術(shù)以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在疾病機(jī)制、分類、治療、結(jié)局預(yù)測(cè)、藥物篩選、聯(lián)合用藥等醫(yī)學(xué)研究中得以廣泛應(yīng)用。

2.1 發(fā)病機(jī)制研究 SCNP技術(shù)能分析患者的不同類型細(xì)胞的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)譜，更深刻了解腫瘤、自身免疫性疾病的本質(zhì)。

利用SCNP技術(shù)，Longo等［3］發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞BCR依賴anti-IgD誘導(dǎo)的激活通路蛋白 Syk、SFK、S6、Akt、Erk、p38的磷酸化水平亞裔美國(guó)人低于歐裔美國(guó)人，證實(shí)了相同信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)譜在人種間并不相同。高齡人群中CD45RA+細(xì)胞毒性T細(xì)胞的比例降低，與該細(xì)胞生存、增殖、分化密切相關(guān)的JAK-STAT信號(hào)反應(yīng)性亦下降，證實(shí)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜于不同年齡表現(xiàn)出差異。David關(guān)于AML的治療藥物阿糖胞苷、吉妥單抗、地西他濱、阿扎胞苷、氯法拉濱的體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在不同急性白血病患者骨髓細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答和凋亡信號(hào)特征完全不同，從而不同患者對(duì)藥物的反應(yīng)性也不相同，證實(shí)了患有相同疾病個(gè)體間細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜并不相同。Steven的研究還提示，屬同一年齡段或同一細(xì)胞表型的AML個(gè)體患者均具有各自與疾病結(jié)局密切相關(guān)特殊信號(hào)網(wǎng)絡(luò)譜。AML的研究顯示，不同DNA損傷引起的凋亡與細(xì)胞Jak／Stat和PI3K信號(hào)通路模式密切相關(guān)［5］。通過(guò) SCNP分析后發(fā)現(xiàn)在不同細(xì)胞亞群中，該通路的多個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白磷酸化水平截然不同，說(shuō)明信號(hào)網(wǎng)絡(luò)譜于不同類型細(xì)胞間并不相同［23］。因此，不同的人種、個(gè)體、年齡段、細(xì)胞類型之間的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜均不同，提示疾病形成機(jī)制的可能不同。

此外，研究表明細(xì)胞處于非靜止?fàn)顟B(tài)能夠提供更豐富的信息。例如，F(xiàn)MS樣酪氨酸激酶受體3（FLT3）的變異（FLT3-ITD）程度一般作為白血病診斷復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)［24］，但是應(yīng)用SCNP技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下，野生型和變異型FLT3的變異頻率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，當(dāng)相關(guān)癌癥因子的刺激下，F(xiàn)LT3與FLT3-ITD對(duì)FLTL（FMS樣酪氨酸激酶受體配體）的敏感性與信號(hào)應(yīng)答范圍不同，后者的應(yīng)答范圍明顯比前者小，例如，與FLT3L相關(guān)的PI3K和Ras／Raf／Erk信號(hào)通路的反應(yīng)性降低，p-stat5的反應(yīng)性增強(qiáng)，IL-27刺激的Jak／Stat信號(hào)通路的反應(yīng)性亦降低［25］，而這一特點(diǎn)集中體現(xiàn)于疾病復(fù)發(fā)病例中。因此，SCNP分析，整合了細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生物信息學(xué)于一體，這將更深刻了解在不同環(huán)境下細(xì)胞表型、功能和行為特征，并在細(xì)胞水平上解釋疾病在不同個(gè)體發(fā)展過(guò)程與結(jié)局并不相同的原因?；诖?，SCNP亦將促進(jìn)個(gè)性化治療的實(shí)現(xiàn)。

2.2 疾病分類 細(xì)胞信號(hào)異常是細(xì)胞遺傳、表觀遺傳和生物分子異常的集中體現(xiàn)，細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜比臨床癥狀所包含疾病信息更加豐富，通過(guò)SCNP分析疾病的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)譜，對(duì)疾病重新分類，促使更有效的診療方法產(chǎn)生，亦可為早期診斷、藥物選擇等提供信息［23］。

例如，通常只有60%AML的患者對(duì)普通化療有效，應(yīng)用SCNP分析發(fā)現(xiàn)，化療完全敏感型的病例都具有完整的凋亡的信號(hào)通路，而不敏感型則表現(xiàn)出Akt通路蛋白的磷酸化程度比敏感型患者高（FLT3L介導(dǎo)的p-AKT、p-Erk表達(dá)信號(hào)增強(qiáng)）［7］；Rosen等研究表明抗腫瘤藥吉妥單抗，能夠緩解AML患者的臨床癥狀和提高生存率，而部分患者明顯耐藥，其部分原因是細(xì)胞AKT信號(hào)通路的激活，拮抗吉妥單抗誘導(dǎo)凋亡作用。表明相同疾病的不同病人其細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)譜的差異，導(dǎo)致了治療的應(yīng)答結(jié)果亦不相同。因此，不同于傳統(tǒng)的疾病分類（細(xì)胞表型、復(fù)發(fā)與否、惡性與良性），信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜是在分子或蛋白水平上將疾病重新精確分類。

2.3 疾病診斷及預(yù)后預(yù)測(cè) SCNP方法可監(jiān)測(cè)異常細(xì)胞群的細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜的變化，確定診斷的最佳時(shí)間，提高早期診斷的特異性。例如AML治療中，除了分析AML細(xì)胞數(shù)量和免疫表型外，檢測(cè)不同類型細(xì)胞內(nèi)異常信號(hào)通路，為后續(xù)合理治療提供幫助，與細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法確定異常細(xì)胞免疫表型相比，SCNP則更加靈敏。另外，依賴于信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜的疾病精確分類，可促進(jìn)新型的診斷方法的建立。研究信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜與疾病結(jié)果間的關(guān)系，將有助于對(duì)疾病結(jié)局的預(yù)測(cè)。例如，Kotecha等［26］對(duì)白血病幼年型粒-單核細(xì)胞白血?。╦uvenilemyelomonocytic leukemia，JMML）的研究中發(fā)現(xiàn)全血或骨髓中細(xì)胞亞群CD33+CD14+CD38low對(duì)GM-CSF異常敏感，p-Stat5的磷酸化水平會(huì)明顯增強(qiáng)，該信號(hào)特征僅出現(xiàn)在JMML復(fù)發(fā)的病人，這一發(fā)現(xiàn)對(duì)疾病結(jié)局預(yù)測(cè)以及治療靶標(biāo)的選擇具有重要意義。Irish等［23］利用SCNP技術(shù)發(fā)現(xiàn)急性白血病細(xì)胞內(nèi)G-CSF誘導(dǎo)的p-Stat3與p-Stat5信號(hào)通路具有重要的預(yù)測(cè)價(jià)值。關(guān)于AML治療效果的評(píng)價(jià)中，Komblau［7］利用SCNP研究發(fā)現(xiàn)除FLT3L變異之外，F(xiàn)LT3L介導(dǎo)的p-AKT，p-ErR表達(dá)信號(hào)增強(qiáng)亦可以預(yù)測(cè)AML復(fù)發(fā)的可能性。

2.4 藥物研發(fā) 通常根據(jù)細(xì)胞靶標(biāo)覆蓋度和藥物選擇性來(lái)完成藥物的初期篩選，其后的工作重點(diǎn)是候選藥物的劑量及其調(diào)整。SCNP技術(shù)可在病例少、短時(shí)間、小投入的情況下能完成更有效的藥物篩選。

SCNP技術(shù)具有在系統(tǒng)水平上，可檢測(cè)原代細(xì)胞的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)特征，并兼具高通量分析的能力，決定了其在篩選安全、穩(wěn)定和有效藥物的明顯優(yōu)勢(shì)。Krutzik等［27］結(jié)合FCB（fluorescent cell barcoding）細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，選擇小鼠的脾臟和外周血細(xì)胞，在96孔板上，利用SCNP技術(shù)對(duì)235個(gè)小分子化合物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)化合物對(duì)信號(hào)通路有選擇性作用。例如，B細(xì)胞內(nèi)，NSC210236抑制IL-6誘導(dǎo)的pStat3磷酸化的程度較其對(duì)IL-10誘導(dǎo)的pStat3和IL-4誘導(dǎo)的pStat5的抑制程度大。并且上述大部分藥物表現(xiàn)出對(duì)B細(xì)胞的IL-6誘導(dǎo)的pStat3的抑制作用較強(qiáng)，而在T細(xì)胞中作用弱，表明化合物對(duì)信號(hào)通路的抑制作用亦有細(xì)胞類型選擇性。他們還發(fā)現(xiàn)，增加同時(shí)分析細(xì)胞信號(hào)通路數(shù)目時(shí)，藥物選擇性降低，表明藥物的選擇性是相對(duì)的，這有利于藥物副作用的評(píng)估，提高藥物篩選的安全性［28］。Bodenmiller等［29］利用 CyTOF流式細(xì)胞儀，同時(shí)結(jié)合MCB（mass-tag cellular barcoding）細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)，分析了12個(gè)激酶刺激因子在8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)人類外周血有核細(xì)胞的14個(gè)細(xì)胞亞群，共186個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白的作用情況進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)SCNP技術(shù)不僅能提供體內(nèi)藥物效應(yīng)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)的信息，還可提示細(xì)胞間信息交流情況，有助于化合物成藥性分析。例如在研究中，INF-α誘導(dǎo)的pStat1的磷酸化水平在CD14+與CD14-T細(xì)胞中，隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，而NK細(xì)胞與lgM+B細(xì)胞與lgM-B細(xì)胞的pStat1磷酸化始終維持在中等水平；對(duì)LPS的刺激的時(shí)程分析中，T細(xì)胞和NK細(xì)胞的STAT3、STAT5與ITK的磷酸化出現(xiàn)于刺激后的2 h，而B(niǎo)細(xì)胞的STAT1的磷酸化出現(xiàn)于刺激后的4 h，研究者認(rèn)為可能是由于IL-6或者其他因子之間交流所致。

除上述外，腫瘤、免疫性疾病的治療中，利用SCNP分析，可以發(fā)現(xiàn)藥物新靶標(biāo)（通常為節(jié)點(diǎn)蛋白），根據(jù)新靶標(biāo)選擇藥物、設(shè)計(jì)聯(lián)合用藥方案；其次，用藥劑量決定了細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)修飾程度，后者又決定臨床治療效果，SCNP在細(xì)胞水平上可分析用藥后，細(xì)胞內(nèi)節(jié)點(diǎn)蛋白狀態(tài)，從而評(píng)估藥物的效能；第三，SCNP技術(shù)亦可應(yīng)用于給藥監(jiān)測(cè)，依據(jù)藥物靶標(biāo)的修飾狀態(tài)（通常監(jiān)測(cè)血藥濃度）來(lái)調(diào)整劑量以及判斷有效劑量。故SCNP可以更全面、更有效地為臨床藥物的選擇提供豐富信息，并且SCNP亦會(huì)是臨床前期藥物試驗(yàn)的有力手段。

最后，與非細(xì)胞依賴性的藥物篩選技術(shù)相比，SCNP技術(shù)檢測(cè)未分離組織的（全血、骨髓）細(xì)胞靶標(biāo)狀態(tài)，準(zhǔn)確代表藥物結(jié)合靶標(biāo)的實(shí)際環(huán)境，提高了實(shí)驗(yàn)研究與臨床關(guān)聯(lián)性。在數(shù)據(jù)分析方面，傳統(tǒng)藥物篩選技術(shù)，常因“數(shù)據(jù)平均”處理導(dǎo)致數(shù)量較少細(xì)胞群的重要信息丟失，SCNP技術(shù)則可避免這一缺陷。例如Todd M利用SCNP技術(shù)分析PI3K與 Jak／Stat通路（前者影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，后者則影響細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平）調(diào)節(jié)因子的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，獲得（重復(fù)100次）的調(diào)節(jié)因子的IC50值時(shí)，僅需80個(gè)細(xì)胞。因此，對(duì)數(shù)量極少的造血干細(xì)胞與腫瘤殘留細(xì)胞（minimum residual disease，MRD）的生物學(xué)特征的分析成為了可能，這將對(duì)腫瘤復(fù)發(fā)研究有重要意義。

3 展望

SCNP以多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ)，在單細(xì)胞水平對(duì)復(fù)雜組織（如外周血、骨髓、腫瘤組織等）進(jìn)行細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)譜分析，該方法優(yōu)勢(shì)明顯，第一，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行物理分離，又可避免“平均效應(yīng)”而丟掉數(shù)量較少，但可能發(fā)揮關(guān)鍵作用細(xì)胞信息的丟失，在治療后腫瘤復(fù)發(fā)等研究中有重要意義。第二，由于個(gè)體間、細(xì)胞類型間以及信號(hào)通路間單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)譜具有特異性，相應(yīng)地，藥物作用也表現(xiàn)出這3種選擇性，這可為組合用藥及個(gè)體化治療提供實(shí)驗(yàn)支持。第三，SCNP還能提供大量節(jié)點(diǎn)蛋白間的反饋調(diào)節(jié)及不同細(xì)胞間相互交流的豐富信息，因此，在藥物篩選、藥物濃度動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及藥物副作用評(píng)估方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。最后該方法分析速度快、投入少，據(jù)2012年8月輝瑞制藥商與美國(guó)生物技術(shù)公司Nodality達(dá)成單細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)譜分析技術(shù)合作協(xié)議，可預(yù)見(jiàn)SCNP在疾病機(jī)制研究以及藥物研發(fā)方面的應(yīng)用前景廣闊。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Covey TM，Putta S，Cesano A.Single cell network profiling（SCNP）：Mapping drug and target interactions［J］.Assay Drug Dev Technol，2010，8（3）：321-43.

［2］ Krutzik PO，Hale M B，Nolan GP.Characterization of themurine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry［J］.J Immunol，2005，175（4）：2366-73.

［3］ Longo D M，Louie B，Putta S，et al.Single-cell network profiling of peripheral blood mononuclear cells from healthy donors reveals age-and race-associated differences in immune signaling pathway activation［J］.J Immunology，2012，188（4）：1717-25.

［4］ Gibbs K D Jr，Gilbert PM，Sachs K，et al.Single-cell phosphospecific flow cytometric analysis demonstrates biochemical and functional heterogeneity in human hematopoietic stem and progenitor compartments［J］.Blood，2011，117（16）：4226-33.

［5］ Rosen D B，Putta S，Covey T，et al.Distinct patterns of DNA damage response and apoptosis correlate with Jak／Stat and PI3Kinase response profiles in human acutemyelogenous leukemia［J］.PLoSOne，2010，5（8）：e12405.

［6］ Kornblau SM，Minden M D，Rosen D B，et al.Dynamic singlecell network profiles in acutemyelogenous leukemia are associated with patient response to standard induction therapy［J］.Clin Cancer Res，2010，16（14）：3721-33.

［7］ Hale M B，Krutzik PO，Samra SS，et al.Stage dependent aberrant regulation of cytokine-STAT signaling inmurine systemic lupus erythematosus［J］.PLoSOne，2009，4（8）：e6756.

［8］ Leslie D，Lipsky P，Notkins A L.Autoantibodies as predictors of disease［J］.JClin Invest，2001，108（10）：1417-22.

［9］ Braqado P，Estrada Y，Sosa M S，et al.Analysis ofmarker-defined HNSCC subpopulations reveals a dynamic regulation of tumor initiating properties［J］.PLoSOne，2012，7（1）：e29974.

［10］Choijamts B，Jimi S，Kondo T，et al.CD133+cancer stem celllike cells derived from uterine carcinosarcoma（malignant mixed Mullerian tumor）［J］.Stem Cells，2011，29（10）：1485-95.

［11］Yang J，Luo H，Li Y，Li J，et al.Intratumoral heterogeneity determines discordant results of diagnostic tests for human epidermal growth factor receptor（HER）2 in gastric cancer specimens［J］.Cell Biochem Biophys，2012，62（1）：221-8.

［12］Covey T M，Cesano A，Parkinson D R，et al.Single-cell network profiling（SCNP）by flow cytometry in autoimmune disease［J］.Autoimmunity，2010，43（7）：550-9.

［13］Bendall SC，Nolan G P，Roederer M，et al.A deep profiler′s guide to cytometry［J］.Trends Immunol，2012，33（7）：323-32.

［14］Bendall SC，Nolan G P.From single cells to deep phenotypes in cancer［J］.Nat Biotechnol，2012，30（7）：639-47.

［15］ Chattopadhyay P K，Roederer M.Cytometry：today＇s technology and tomorrow＇s horizons［J］.Methods，2012，57（3）：251-8.

［16］Suda T，Takubo K，Semenza G L.Metabolic Regulation of Hematopoietic Stem Cells in the Hypoxic Niche［J］.Cell Stem Cell，2011，9（4）：298-310.

［17］Havenith SH，Yong S L，Henson SM，et al.Analysis of stemcell-like properties of human CD161++IL-18Rα+memory CD8+T cells［J］.Int Immunol，2012，24（10）：625-36.

［18］Gattinoni L，Lugli E，Ji Y，et al.A human memory T cell subset with stem cell-like properties［J］.NatMed，2011，17（10）：1290-7.

［19］Roederer M，Moody M A.Polychromatic plots：graphical display ofmultidimensional data［J］.Cytometry A，2008，73（9）：868-74.

［20］ Boedigheimer M J，F(xiàn)erbas J.Mixture modeling approach to flow cytometry data［J］.Cytometry A，2008，73（5）：421-9.

［21］Chan C，F(xiàn)eng F，Ottinger J，et al.Statisticalmixturemodeling for cell subtype identification in flow cytometry［J］.Cytometry A，2008，73（8）：693-701.

［22］Qiu P，Simonds E F，Bendall SC，etal.Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE［J］.Nat Biotechnol，2011，29（10）：886-91.

［23］Irish JM，Hovland R，Krutzik PO，et al.Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells［J］.Cell，2004，118（2）：217-28.

［24］Baldus C D，Thiede C，Soucek S，et al.BAALC expression and FLT3 internal tandem duplicationmutations in acutemyeloid leukemia patients with normal cytogenetics：prognostic implications［J］.JClin Oncol，2006，24（5）：790-7.

［25］D?hner H，Estey E H，Amadori S，et al.Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults：recommendations from an international expert panel，on behalf of the European Leukemia［J］.Blood，2010，115（3）：453-74.

［26］Kotecha N，F(xiàn)lores N J，Irish JM，etal.Single-cell profiling identifies aberrant STAT5 activation in myeloid malignancies with specific clinical and biologic correlates［J］.Cancer Cell，2008 14（4）：335-43.

［27］Krutzik PO，Nolan G P.Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling［J］.Nat Methods，2006，3（5）：361-8.

［28］Krutzik PO，Crane JM，Clutter M R，Nolan G P.High-content single-cell drug screeningwith phosphospecific flow cytometry［J］.Nat Chem Biol，2008，4（2）：132-42.

［29］Bodenmiller B，Zunder ER，F(xiàn)inck R，etal.Multiplexedmass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators［J］.Nat Biotechnol，2012，30（9）：858-67.