孫夢雯，胡世蓮，殷 實(shí)，嚴(yán) 光

（安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院老年病科，安徽省老年病研究所，安徽合肥 230001）

我國是肝病大國，由于乙肝疫苗的普及、抗肝炎病毒藥物的應(yīng)用和傳染病防治方法的有效實(shí)施，病毒性肝炎新發(fā)病例不斷減少；與之相反，隨著人民生活水平的提高，肥胖、糖尿病和酒精濫用相關(guān)肝病的發(fā)病率迅速增加，可以預(yù)計(jì)，未來10～20年酒精性或者肥胖引起的肝病，將取代病毒性肝病成為嚴(yán)重影響人民健康的主要病因。但這方面國家投入和研究水平仍亟待加強(qiáng)，特別是酒精引起的酒精性肝?。╝lcoholic liver disease，ALD）長期沒有得到應(yīng)有的重視。

長期飲酒是全世界導(dǎo)致慢性肝病的重要原因，可導(dǎo)致肝硬化和肝癌。幾乎所有的重度飲酒者發(fā)展為脂肪肝，其中只有20%～40%可發(fā)展為嚴(yán)重ALD包括酒精性肝炎、酒精性肝纖維化等，嚴(yán)重威脅人類健康。ALD缺乏有針對(duì)性的靶點(diǎn)治療方法，臨床上只能以對(duì)癥治療為主，因此，建立更接近人類酒精性動(dòng)物模型是進(jìn)而利用動(dòng)物模型研究發(fā)生機(jī)制研究并篩選有效治療ALD藥物的基石［1］。目前，國際上通用的ALD動(dòng)物模型有兩種，大都有關(guān)ALD機(jī)制成果均來源于這些動(dòng)物模型研究成果［1］。ALD動(dòng)物模型一為液體酒精飼料喂飼，另一種為手術(shù)置胃管。但二者均存在嚴(yán)重不足，前者損傷輕微，后者費(fèi)用高難度大，動(dòng)物易死亡。二者的共同缺點(diǎn)是和人類ALD的病理改變有相當(dāng)大的差距，這大大妨礙了ALD的機(jī)制研究及后續(xù)ALD治療方法的研究。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）酒精研究所（NIAAA）肝病研究室（Laboratory of Liver Diseases）新近建立的乙醇誘導(dǎo)急性小鼠酒精性肝損傷模型［2］。研究表明，氧自由基和炎癥參與了酒精肝的病理過程［2］。近年發(fā)現(xiàn)，腦腸肽是生長激素釋放促分泌素受體的一種內(nèi)源性配體，因?yàn)樗写貵H釋放功能，所以被命名為腦腸肽。最近研究表明，腦腸肽對(duì)非酒精脂肪肝具有保護(hù)作用［3］，亦有研究表明，腦腸肽具有抗炎作用［4］，基于以上研究基礎(chǔ)，我們?cè)谝M(jìn)最新酒精性動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，研究了腦腸肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑 腦腸肽系美國Sigma公司產(chǎn)品，腦腸肽臨用前先用無菌生理鹽水稀釋。Lieber-DeCarli酒精液體飼料（標(biāo)準(zhǔn)型，酒精熱量36%），產(chǎn)品號(hào)：TP-4030，購自南通特洛菲飼料科技有限公司。酒精為工業(yè)純級(jí)別（99.9%）。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20021129；天冬門氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20021129；超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20021219；GSH-px測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，批號(hào)：20021207。

1.2 動(dòng)物模型的建立 根據(jù)文獻(xiàn)模型稍有改進(jìn)［5］。C57／B6小鼠，8～10周齡，體質(zhì)量（30±2）g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。給予含5%乙醇的液體飼料，自由喂養(yǎng)4周，最后1次按5 g·kg-1的劑量給予酒精灌胃1次，9 h后自小鼠后眼眶靜脈叢采血，分離血清，4℃保存待測轉(zhuǎn)氨酶活性。頸椎脫臼法處死動(dòng)物，立即摘取肝臟標(biāo)本，部分甲醛固定留待病理檢查，取部分肝組織-70℃保存待測。

1.3 動(dòng)物分組及處理 設(shè)正常對(duì)照組、模型組、腦腸肽給藥組（5、10、20μg·kg-1）。將動(dòng)物按體重分層隨機(jī)分組，每組6只。正常對(duì)照組等量生理鹽水腹腔注射（ip）；預(yù)防用藥方案：從造模d 1起，按上述劑量給予腦腸肽腹腔注射，每天1次。

1.4 檢測指標(biāo)及方法 ALT、AST、MDA、GSH-Px、SOD測定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1．5 小鼠肝臟H＆E染色 采用常規(guī)病理方法。簡言之，10%的中性甲醛固定，制備石蠟包塊，切片，HE染色，顯微鏡下觀察肝臟病理改變。

1．6 肝臟中RNA的抽提及相關(guān)基因表達(dá)水平的定量RT-PCR（real-time PCR）檢測 肝臟中RNA采用 RNeasy Mini Kit（Qiagen Inc，Stanford Santa Clarita，CA，USA）方法抽提，按試劑盒說明書進(jìn)行，測定RNA純度和濃度。隨后進(jìn)行 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：1 μg RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.Applied Biosystems，Bedford，MA，USA）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后使用定量PCR反應(yīng)體系：使用iTaq SYBR Green Supermix（iTaq SYBR Green Supermix With ROX BIO-RAD.Hercules，CA，USA）加入10μmol·L-1primers，2μl of cDNA。定量PCR反應(yīng)使用儀器為7500 Fast Real-Time PCR System.（AB Applied Biosystems，Carlsbad，California，USA），反應(yīng)條件為：95℃ 3 min，40 cycles of 95℃ （25 s），58℃ （25 min），and 72℃ （1 min）。每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。使用引物序列見Tab 1。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，組間差異用ANOVA法進(jìn)行分析比較，顯著性差異P值設(shè)定為0.05。

2 結(jié)果

2.1 腦腸肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠轉(zhuǎn)氨酶的影響在序貫給予酒精飼料4周后，模型組血清ALT、AST活性升高，而在序貫期間預(yù)防給藥，分別給予ip腦腸肽（5、10、20μg·kg-1）均能降低血清中升高的ALT、AST活性，在腦腸肽的3個(gè)劑量中以20μg·kg-1為最明顯（Fig 1）。

Tab 1 Primer sequence

Fig 1 Ghrelin alleviates ethanol-induced liver injuryA：Serum transaminase ALT；B：AST levels；*P＜0.05，**P＜0.01 denotes significant difference from corresponding ethanol-fed model groups.ALT：alanine transaminase；AST：aspartate aminotransferace.

2.2 腦腸肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟病理的影響HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組肝內(nèi)出現(xiàn)彌漫性脂肪病變，以3區(qū)為主，肝血竇充血明顯，可見少許炎細(xì)胞浸潤。腦腸肽處理可減輕炎癥細(xì)胞浸潤，但對(duì)脂肪病變影響不明顯（Fig 2）。

Fig 2 Ghrelin im proves ethanol-induced liver pathologic change

2.3 腦腸肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠自由基的影響模型組肝勻漿MDA水平升高，GSH-Px和SOD活性降低。預(yù)防給予 ip腦腸肽（5、10、20μg·kg-1）均能降低肝勻漿中升高M(jìn)DA的水平，并能提高肝勻漿GSH-Px和SOD活性（Tab 2）。

Tab 2 Effects of ghrelin adm inistration on hepatic MDA levels，SOD and GSH-Px activities in alcohol fatty liver

2.4 腦腸肽對(duì)酒精性肝損傷小鼠炎癥細(xì)胞因子的影響 與正常組相比，模型組肝臟炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和 MCP-1明顯升高。預(yù)防給予 ip腦腸肽（5、10、20μg·kg-1）均能降低上述炎性細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)（Fig 3）。

3 討論

酒精性肝損傷動(dòng)物模型的建立一直以來是酒精研究領(lǐng)域的難點(diǎn)，以往應(yīng)用最為廣泛的酒精性肝損害的模型是應(yīng)用含酒精的Lieber-DeCarli液體飲食喂養(yǎng)小鼠4～6周，但是這種模型僅僅只能誘發(fā)輕度脂肪變性，輕度的血清ALT升高，極少量甚至無炎癥。因此，建立一種具有明顯肝細(xì)胞損害和纖維化的重度酒精肝模型至關(guān)重要。最近NIAAA建立了一種慢性酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃的小鼠模型（NIAAA模型，國內(nèi)亦稱高氏Gao-Binge模型）。這種模型模仿多數(shù)酒精性肝炎患者的飲酒方式，即這些患者有多年慢性飲酒的背景，以及近期醉酒的病史。在小鼠身上即可協(xié)同作用導(dǎo)致小鼠的脂肪變性、肝臟損傷和炎癥［1，5］。目前，全世界許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)應(yīng)用這種經(jīng)過修正的慢性酒精喂養(yǎng)加酒精灌胃的小鼠和大鼠模型。NIAAA建立的慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃的模型，除了容易操作外，還具有費(fèi)用低和時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)。用含酒精的Lieber-DeCarli飲食喂養(yǎng)小鼠10 d或者延長至4～8周，然后用單劑酒精灌胃（5 g·kg-1）1次，會(huì)導(dǎo)致血清ALT和AST明顯升高，灌胃后9 h在C57BL／6小鼠達(dá)到峰值，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)慢性酒精喂養(yǎng)的小鼠。這種模型還也可以改進(jìn)為慢性酒精喂養(yǎng)更長時(shí)間加多次酒精灌胃［1，5］。

Fig 3 Ghrelin attenuates alcohol-induced proinflammatory cytokine and chemokinemRNA expression in the liver*P＜0.05，**P＜0.01 denotes significantdifference from corresponding ethanol-fedmodel groups.TNF：tumor necrosis factor；IL：interferon；MCP-1：monocyte chemoattractant protein 1.

ALD主要是乙醇及其衍生物的代謝過程中直接或間接誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腸源性內(nèi)毒素（LPS）、炎性介質(zhì)和營養(yǎng)失衡（尤其是蛋白質(zhì)一熱量營養(yǎng)不良）等多種因素相互作用的結(jié)果。酒精通過氧化應(yīng)激促使反應(yīng)性氧化物增加，而誘發(fā)肝臟脂肪聚集。在氧化應(yīng)激相關(guān)的脂質(zhì)過氧化，同時(shí)LPS在ALD時(shí)水平升高，可促進(jìn)肝臟炎性細(xì)胞因子增加，氧自由基和炎性細(xì)胞因子的雙重作用下可導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡、壞死，造成炎癥、壞死甚至纖維化［2，6］。因此抗氧化抗炎治療有望對(duì)抗ALD疾病的病理進(jìn)展［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，腦腸肽可明顯降低增高的血清轉(zhuǎn)氨酶活性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)腦腸肽具有抗氧化作用，其依據(jù)為腦腸肽可明顯降低ALD小鼠肝勻漿中升高的MDA水平，同時(shí)提高肝勻漿SOD和GSH-Px活性，提示腦腸肽對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用與抗脂質(zhì)過氧化和提高機(jī)體的抗氧化酶活性有關(guān)。最新的研究表明，腦腸肽在高脂肪引起的脂肪肝大鼠模型中具有抗自由基作用［8］；體外實(shí)驗(yàn)也表明，腦腸肽具有抗氧化作用［9］。本研究亦證實(shí)腦腸肽在酒精肝模型亦可降低肝損傷時(shí)脂質(zhì)過氧化物的生成，同時(shí)可提高抗氧化酶活性。因此，腦腸肽在酒精性肝損傷動(dòng)物模型中亦可發(fā)揮其抗氧化作用。雖然有人體實(shí)驗(yàn)表明給予褪黑素可以提高體內(nèi)腦腸肽水平，進(jìn)而減輕脂肪性肝炎程度［10］，但腦腸肽對(duì)人類ALD是否同樣的抗氧化作用，仍需要在臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步研究加以證實(shí)。

大量研究表明，天然免疫反應(yīng)參與了ALD的病理生理過程［11］，其中內(nèi)毒素介導(dǎo)性細(xì)胞因子釋放引起的免疫反應(yīng)在ALD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［1，6，12］，本研究發(fā)現(xiàn)，腦腸肽可明顯降低肝臟內(nèi)炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，這可能是腦腸肽保護(hù)酒精肝的重要機(jī)制之一。在過去的10年中對(duì)腦腸肽的抗炎作用頗有研究，腦腸肽不僅在休克的過程中發(fā)揮抑制炎癥的作用，而且體內(nèi)外的研究均表明腦腸肽具有明顯的抗炎作用，可能成為炎癥性疾病和損傷的潛在治療藥物。此外，腦腸肽還可以在骨髓和胸腺中促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化，延緩衰老相關(guān)的胸腺萎縮［4，13］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明腦腸肽具有抗炎作用，可降低大鼠脊髓損傷后中性粒細(xì)胞浸潤和DNA損傷［14］。而最新研究表明腦腸肽還具有心臟保護(hù)作用，其保護(hù)作用亦與其抗炎作用有關(guān)［15］。本研究首次在酒精性肝損傷動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn)腦腸肽的抗炎作用，腦腸肽可抑制酒精引起的肝臟炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。而腦腸肽通過何種機(jī)制抑制炎性細(xì)胞因子的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，腦腸肽對(duì)小鼠酒精性肝損傷具保護(hù)作用，其機(jī)制與其抗氧化抗炎作用有關(guān)。

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