薛延香，詹雪靈，劉 影，沈仁澤，晉冰玉，高 杰

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院·南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515)

聚乳酸－羥基乙酸共聚物［poly(1actide－coglycolide)，PLGA］是一種廣泛用于制備生物膜或支架的合成聚合物之一，不僅具有良好的生物相容性和低毒性，而且還可通過調(diào)整共聚物中聚乳酸與聚羥基乙酸的比例而使其降解率從幾周到幾年不等［1－4］。殼聚糖(Chitosan，CS)是甲殼素脫乙酰基的產(chǎn)物，富含正電荷，其結(jié)構(gòu)與細胞外基質(zhì)中的多糖類似，且具有較好的生物相容性、降解性、無毒性、抑菌性、抗炎性、止血及促進傷口愈合等生物學(xué)特性［5－9］。由于PLGA和CS具有較好的生物學(xué)特性，兩者均被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

目前，CS和PLGA納米粒(粒徑1～1 000 nm)主要作為載體攜帶藥物或生物活性分子等，以達到緩釋的目的［7，10－11］。PLGA 可操作性好且易于成形，但由于其親水性差，不利于細胞的黏附;而CS雖親水性相對較好，但其降解較快。因此，有學(xué)者提出，若將CS與PLGA混合不僅可提高其細胞的黏附性，并能縮短PLGA的降解時間［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，用于組織工程的納米級材料與普通材料相比擁有更佳的特性，能夠更好地模擬人體器官或組織的微結(jié)構(gòu)［13－14］。但應(yīng)用前需確保納米材料在發(fā)揮其應(yīng)有作用時不會對機體產(chǎn)生毒副作用。目前尚未發(fā)現(xiàn)PLGA和CS 2種納米粒混合材料用于牙周組織修復(fù)的相關(guān)研究。因此，本實驗旨在制備PLGA、CS納米粒，并初步觀察其對人牙周膜細胞的毒性，為后期PLGA與CS納米粒最佳混合比例的研究和3D打印復(fù)合納米支架的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

PLGA(75∶25，粘度 0.46，山東省醫(yī)療器械研究所);CS(脫乙酰度≥95%，粘度40～100 MPa.s，廣州天俊公司);聚乙烯醇、多聚磷酸鈉(Sigma，美國);DMEM培養(yǎng)基(HyClone，美國);胎牛血清(FBS，Sciencell，美國);青/鏈霉素(青 10 KU/mL，鏈 10 mg/mL，Solarbio);2.5 g/L 胰酶/0.2 g/L EDTA消化液(吉諾);Ⅰ型膠原酶(BIOSHARP);四甲基偶氮唑鹽(MTT，BIOSHARP);LEGENP MICRO 17R離心機(Thermo，美國);JY92－IIN超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司);GalaxyS+50 mL/L CO2恒溫孵箱(RSBiotech，英國);Malvern Zetasizer 3000HS(Malvern，英國);H－9500透射電子顯微鏡(Hitachi，日本);RET basic safety control磁力攪拌器(IKA，德國);SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)。

1.2 PLGA、殼聚糖納米粒的制備

采用乳化溶劑揮發(fā)法［15］制備PLGA納米粒:將100 mg PLGA溶于10 mL丙酮中，室溫下磁力攪拌8 00 r/min至完全溶解后緩慢倒入40 mL 20 mg/mL聚乙烯醇溶液中，并繼續(xù)磁力攪拌8 h;待溶劑完全揮發(fā)后(溶液呈淡藍色)，13 300 r/min離心15 min，去上清，沉淀部分用去離子水清洗3次并重懸后，超聲處理20 s，自然風(fēng)干備用。

用離子交聯(lián)法［16］制備殼聚糖納米粒:將20 mg CS溶于20 mL 1 mL/mL的冰醋酸溶液中，室溫下磁力攪拌至完全溶解后，用10 moL/L－NaOH調(diào)節(jié)pH至4.6～6.0，然后再在磁力攪拌下將5 mL濃度為1 mg/mL的多聚磷酸鈉溶液，逐滴滴入殼聚糖溶液中(約15 s/滴)，待溶液呈淡藍色時，13 300 r/min離心 15 min，去上清，沉淀部分用去離子水清洗3次并重懸后，超聲處理20 s，自然風(fēng)干備用。

1.3 PLGA、殼聚糖納米粒的粒徑及形態(tài)觀察

取 PLGA、CS納米粒懸液適量，用 Malvern Zetasizer 3000HS儀分別測定納米粒的平均粒徑及分散系數(shù)。

分別將適量PLGA、CS納米粒懸液滴于銅網(wǎng)上，靜置2 min后用鑷子夾起銅網(wǎng)，并用濾紙吸去多余液體;室溫下干燥后，置于透射電鏡下觀察并進行拍照。

1.4 人牙周膜細胞培養(yǎng)

選取12～24周歲志愿者(知情同意)因正畸或阻生拔除的無齲、無牙周炎的正畸牙或阻生牙，用PBS(含雙抗)沖洗3次后，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，并將其剪碎;然后用DMEM完全培養(yǎng)液沖洗3次，添加200 μLⅠ型膠原酶，置于37℃孵箱中消化10 min，用DMEM完全培養(yǎng)液終止消化后，1 000r/min離心3 min;吸取組織塊平鋪于35 mm的培養(yǎng)皿，并蓋以24 mm×24 mm的蓋玻片后，加入 1.5 mL含 100 mL/L FBS和青霉素10 KU/mL、鏈霉素10 mg/mL的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、50 mL CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。次日換液后每3 d換液1次，當(dāng)爬出細胞達20%時，掀片繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞覆蓋率達到80%后，用2.5 mL胰酶+0.2 g/L EDTA消化液消化，1∶2傳代培養(yǎng)。取3～5代細胞用于實驗。

1.5 PLGA、殼聚糖納米粒的細胞毒性觀察

1.5.1 PLGA、殼聚糖納米粒懸液的制備

分別取γ射線滅菌后的PLGA、CS納米粒及普通粒徑的PLGA、CS粉末，用含100 mL/L FBS和1%青/鏈霉素的 DMEM 配制 0.5、1、2 mg/mL 的PLGA、CS納米粒及1 mg/mL的PLGA、CS粉末完全培養(yǎng)基混懸液并置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 細胞毒性實驗

取3～5代人牙周膜細胞，用2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA 消化后，以(1～5)×103/孔的細胞密度接種于96孔板。常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，并將細胞隨機分為兩大組(PLGA組、CS組);每一大組再各隨機分為5個亞組(空白對照組、普通粉末對照組和3個實驗組)，每組設(shè)6個復(fù)孔。其中3個實驗組分別加入濃度為0.5、1、2 mg/mL的PLGA或CS納米粒完全培養(yǎng)基混懸液;普通粉末對照組加入濃度為1 mg/mL的PLGA或CS粉末全培混懸液;空白對照組僅加入含100 mL/L FBS和青霉素 KU/mL鏈霉素10 mg/mL的 DMEM完全培養(yǎng)基，置于 37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后1、2、3 d各時間點取各組細胞，每孔各加入 20 μL MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h，然后用多功能酶標(biāo)儀測定各孔490 nm波長處的吸光度值(OD值)，實驗重復(fù)3次。所得結(jié)果按以下公式計算各組細胞的相對增殖率(relative growth rate，RGR):RGR(%)=實驗組吸光度值/空白對照組吸光度值×100%。然后根據(jù)RGR，并按細胞毒性分級標(biāo)準(zhǔn)(表1)，對各組的細胞毒性進行評價。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

表1 細胞毒性評價標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 PLGA、CS納米粒的粒徑及形態(tài)表征

2.1.1 納米粒的粒徑大小及分布

馬爾文激光散射粒度儀檢測結(jié)果顯示:PLGA納米粒的粒徑為(188.10±2.86)nm，分散系數(shù)為0.55± 0.04(圖 1a);CS 納米粒的粒 徑 為(250.97±30.86)nm，分散系數(shù)為 0.50 ± 0.07(圖1b)。

2.1.2 納米粒的形態(tài)表征

透射電鏡觀察顯示:PLGA納米粒呈球形，大小均勻，邊緣清晰(圖2a);CS納米粒類似球形，大小較均勻，邊緣清晰(圖2b)。

圖1 PLGA、CS納米粒粒徑分布圖

圖2 PLGA、CS納米粒透射電鏡圖

2.2 PLGA、CS納米粒的細胞毒性

0.5、1、2 mg/mL PLGA、CS 納米粒和 1 mg/mL PLGA、CS粉末與人牙周膜細胞共同培養(yǎng)24、48、72 h后，各組細胞的OD值和相對增殖率(RGR)如表2～3和圖3所示;72 h內(nèi)所有組細胞的相對增殖率均大于85%，其毒性分級均為0或1級;根據(jù)ISO10993－5可以認為所有組對牙周膜細胞均無毒性。隨著培養(yǎng)時間的延長，PLGA納米粒和CS納米粒組牙周膜細胞的OD值也隨之增加。圖3a顯示，48 h時PLGA粉末組和2 mg/mL PLGA納米粒組的OD值低于空白組(P＜0.05);其余各濃度組與空白對照組相比各濃度組間兩兩相比均無明顯差異(P＞0.05);24 h和72 h時，各濃度PLGA納米粒組的OD值與空白對照組相比，以及各濃度組間兩兩相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。圖3b顯示，48 h時，1 mg/mL CS納米粒組和粉末組的OD值均明顯低于空白組(P＜0.05)，其余各濃度組與空白對照組相比，以及各濃度組間兩兩相比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);24 h和72 h時，各濃度CS納米粒組的OD值與空白對照組相比，以及各濃度組間兩兩相比均無明顯差異(P＞0.05)。

表2 培養(yǎng)24、48、72 h后PLGA納米粒組細胞的相對增殖率(%，)

表2 培養(yǎng)24、48、72 h后PLGA納米粒組細胞的相對增殖率(%，)

*與空白對照組相比P＜0.05

時間(h) 空白對照 普通PLGA粉 PLGA(mg/mL)0.5 1 2 24 100(0) 92.1 ±4.6(1) 95.7 ±6.6(1) 93.1 ±1.7(1) 98.4 ±3.9(1)48 100(0) 92.6 ±0.9(1)* 93.8 ±2.1(1) 99.7 ±1.8(1) 89.5 ±1.7(1)*72 100(0) 88.4 ±7.7(1) 99.2 ±3.4(1) 98.4 ±8.0(1) 109.2 ±2.9(0)

表3 培養(yǎng)24、48、72 h后CS納米粒組的相對增殖率(%，)

表3 培養(yǎng)24、48、72 h后CS納米粒組的相對增殖率(%，)

*與空白對照組相比P＜0.05

時間(h) 空白對照 普通CS粉 CS(mg/mL)0.5 1 2 24 100(0) 92.4 ±8.0(1) 93.3 ±2.2(1) 88.8 ±5.9(1) 94.5 ±8.0(1)48 100(0) 97.2 ±5.3(1)*100.1 ±2.9(0) 96.7 ±2.2(1)*100.7 ±5.4(0)72 100(0) 85.6 ±5.6(1) 106.6 ±11.1(0) 94.0 ±6.2(1) 108.1 ±3.1(0)

圖3 PLGA、CS納米粒對牙周膜細胞的毒性(*與空白對照組相比P＜0.05)

3 討論

PLGA已通過美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration ，F(xiàn)DA)的認證［17－18］，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工等各領(lǐng)域。但由于PLGA的表面呈疏水性，不利于細胞的粘附、生長和增殖。由于CS具有良好的細胞相容性、低毒性、降解性、親水性、粘附性、低廉性等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，并成為廣泛應(yīng)用的的天然聚合物之一［7，9］。但是，CS的機械強度差、吸水易變形且降解相對較快，因此不適合單獨應(yīng)用于需要承載負荷或維持一定空間的地方。然而，PLGA和CS聯(lián)用則可以改善降解速率，提高機械強度，以符合特定部位的生理需求。Nandagiri等［19］報道，在殼聚糖－明膠支架中加入PLGA納米粒后，可顯著降低支架對水的攝取，含16.6%(w/w)和 66.6%(w/w)PLGA 納米粒支架的壓縮模量分別比對照組提高了3倍和6倍。

本實驗中PLGA納米粒的制備采用的是乳化溶劑蒸發(fā)法，所用的溶劑為丙酮而不是國外普遍應(yīng)用的二氯甲烷［20－22］。因為在前期實驗中發(fā)現(xiàn)，雖然二氯甲烷的沸點為39.8℃，低于丙酮的沸點(56.48℃)，用其作為溶劑制備PLGA納米粒時雖可縮短時間。但制備出的PLGA不是納米級，一般在幾十到幾百微米不等 。而改用丙酮作為溶劑后，則很容易得到PLGA納米粒。本實驗分別將不同濃度PLGA、CS納米粒與人牙周膜細胞共同培養(yǎng)不同時間后，MTT檢測顯示48 h時，雖然部分組的細胞增殖率明顯低于空白對照組，但在72 h時組間均無統(tǒng)計學(xué)差異，說明48 h時有差異的組在下一個24 h內(nèi)恢復(fù)了較好的增殖能力;在24～72 h內(nèi)，各組牙周膜細胞的相對增殖率均保持在85%以上，說明PLGA、CS納米粒與普通PLGA、CS一樣擁有良好的細胞相容性，對牙周膜細胞無毒性。另外，本課題組曾就殼聚糖納米粒和普通殼聚糖對大腸桿菌的抑菌性進行了比較研究，結(jié)果顯示:在濃度相同情況下殼聚糖納米粒組的抑菌性明顯高于普通組;當(dāng)濃度為2 mg/mL時，納米粒組的抑菌性已達到100%，而普通組則僅為70%左右。以上結(jié)果說明，殼聚糖納米粒比普通殼聚糖具有更好的抑菌性。

牙周炎可以造成患者牙槽骨的吸收，而且不同患者牙槽骨吸收的形態(tài)不同，以前制造生物支架的技術(shù)都只能將支架制備成特定的形態(tài)而不能因人而異。作為生物支架，應(yīng)該最大程度的模擬生物器官或組織的微觀結(jié)構(gòu)以實現(xiàn)個性化治療。近幾年興起的3D打印則可通過對病損區(qū)的掃描，重建病損形態(tài)，從而實現(xiàn)了個體化修復(fù)設(shè)計。本實驗初步研究了PLGA、CS納米粒對牙周膜細胞的毒性，以期為后續(xù)PLGA、CS納米復(fù)合膜或支架的研究及3D打印復(fù)合納米支架的制備奠定基礎(chǔ)。

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