燕傲蕾，葛永斌，郭 慧

亳州師范高等?？茖W校理化系，安徽亳州，236800

自由基是生物代謝過程中出現(xiàn)的中間產物，過量自由基會攻擊生物分子不飽和位點，損傷DNA、蛋白質等有機分子，引起細胞代謝紊亂。在現(xiàn)代快節(jié)奏的生活方式和日光、紫外線、電離輻射等外部不良條件的影響下，人體產生的自由基及其誘導的氧化反應已成為加速細胞衰老、引發(fā)多種疾病的重要因素［1］，機體抗氧化能力的強弱與其健康程度密切相關，食品抗氧化能力的強弱也成為評價其保健能力的重要指標［2］。

啤酒是廣受大眾喜愛的休閑飲品，含有800多種有機、無機化合物，具有一定的抗氧化功能和營養(yǎng)價值［3］。亳菊啤酒兼具啤酒獨特風味和菊花清新適口的特點，且由于亳菊所含的金合歡素、木犀草素等成分的融入，使啤酒具備了亳菊所具備的營養(yǎng)保健功能。研究亳菊啤酒的抗氧化性不僅對提高啤酒的風味穩(wěn)定性有積極意義，而且對其營養(yǎng)價值和保健功能的評價也具有重要的參考價值［4］。由于亳菊啤酒中成分復雜，抗氧化物質眾多，單獨使用一種方法不能準確反映樣品的總抗氧化活性［5］，因此，本實驗采用TRAP、DPPH、ABTS和羥自由基清除四種方法對亳菊啤酒的體外抗氧化性進行研究，以綜合評價其抗氧化能力，為亳菊啤酒的進一步研究和開發(fā)打下基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV759型紫外－可見分光光度計，購自上海精密科學儀器有限公司。

安徽亳州當年產的一級亳菊（Chrysanthemum morifolium（Ramat.）Tzvel CV.），購自亳州市中藥材交易中心。1，1－二苯基－2－苦基苯肼（DPPH，1－diphenyl－2－picryl hydrazyl）、2，4，6－三（2－吡啶基）－1，3，5－三丫嗪（TPTZ，2，4，6－Tris（2－pyridyl）－s－triazine）、2，2＇聯(lián)氨－雙（3－乙基苯并噻唑琳－6－磺酸〉二胺鹽（ABTS，2，2－Azinobis（3－ehtylbenzothiazolin－6－sulfnic Acid）Diammonium Salt）購自Sigma公司，其他化學試劑均為國產分析純（AR）。

1.2 實驗方法

1.2.1 亳菊啤酒生產工藝

在啤酒后酵前期加入亳菊水提液，使亳菊啤酒中亳菊的濃度分別為1、2、3、4、5mg／L（以亳菊干重計），并設一罐不加亳菊的普通啤酒作為對照，具體工藝流程參見葛永斌的方法［6］。

1.2.2 亳菊啤酒體外抗氧化性測定

鐵還原／抗氧化能力（FRAP）法測定總還原力參照Benzie的方法［7］，并略有改動。按0.1mol／L醋酸緩沖試劑（pH3.6）∶10mmol／L TPTZ∶20mmol／L氯化鐵＝10∶1∶1（體積比）的比例混合制成FRAP試劑，取稀釋2倍后的亳菊啤酒0.1mL與3.9mL FRAP溶液混勻，37℃水浴10min后，在593nm處測定吸光值。以1.0mmol／L硫酸亞鐵為標準品制作標準曲線，計算樣品抗氧化活性（FRAP值）。

DPPH·清除實驗在Gorinstenin的方法［8］上略作調整。將亳菊啤酒稀釋5倍后，取0.3mL與2.7mL0.2mmol／L的 DPPH 乙醇溶液混勻，暗處反應30min后在517nm處進行吸光度A1的測定。以0.3mL無水乙醇與2.7mL0.2mmol／L的 DPPH乙醇溶液的混勻物為空白對照測定吸光度A0。

DPPH·清除率（%）＝［（A0－A1）／A0］×100%（1）式中，A0為空白組吸光值；A1為樣品組吸光值。

ABTS＋·清除實驗參照Re的方法［9］并稍作修改。將140mmol／L的過硫酸銅和7mmol／L的ABTS＋·溶液按11∶625的體積比充分混合后，避光反應12～16h制成ABTS＋·儲備液，測定前用無水乙醇將儲備液稀釋，得到在734nm處吸光值為0.700±0.002的ABTS＋·工作液。取稀釋5倍后的亳菊啤酒0.3mL與2.7mL ABTS＋·工作液充分混合，室溫條件下反應10min，以0.3mL蒸餾水與ABTS＋·工作液的混勻液為空白，在734nm處測定吸光值。ABTS＋·清除率按式（1）進行計算。

羥自由基（·OH）清除實驗參照恭菁華的方法［10］，并適當修改。取稀釋2倍后的亳菊啤酒1 mL，加 8.8mmol／L H2O2、9mmol／L FeSO4、9 mmol／L水楊酸－乙醇溶液各1mL，混勻后靜置30min，以蒸餾水為空白對照，在510nm處測定吸光度，·OH清除率的計算同式（1）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均設3個重復，并用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度亳菊啤酒的總抗氧化活性

在酸性條件下，TPTZ可以與Fe3＋形成復合物（Fe3＋－TPTZ），在 還 原 性 物 質 作 用 下，F(xiàn)e3＋－TPTZ會被還原成Fe2＋，從而使溶液呈現(xiàn)為藍色且在593nm處達到最大吸收，還原物質的含量與其吸光度間存在比例關系。FRAP法不僅原理明確、標準化程度高、操作便捷，而且能避免自由基類型不同所引起的差異，是反映樣品總抗氧化活性的常用方法［11］。

不同濃度亳菊啤酒的總還原力如圖1所示（不同的字母表示存在顯著性差異，P＜0.05，下同），隨著亳菊添加濃度的上升，亳菊啤酒的總還原力也在不斷升高，亳菊濃度為1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒總還原力分別為對照組的1.35、1.87、2.19、2.51和2.75倍，且各組間均存在顯著差異（P＜0.05）。可見，添加亳菊可以顯著提高啤酒的總還原力。但是，增加亳菊所引起的總還原力的增幅卻表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。當亳菊添加濃度為2g／L時，增幅最大，比1g／L亳菊啤酒的總還原力高了20.54；當亳菊添加濃度為3、4g／L時，總還原力的增幅穩(wěn)定在12左右；當亳菊添加濃度為5g／L時，亳菊啤酒的總還原力僅比4g／L組高了9.84?？梢?，當亳菊添加濃度較低時，增加亳菊濃度可以顯著提高成品啤酒的總還原力，但隨著添加濃度的上升，這種提升效果越來越弱。

圖1 不同濃度亳菊啤酒的總還原力

2.2 不同濃度亳菊啤酒的DPPH·清除能力

DPPH法自1958年出現(xiàn)后，廣泛用于食品和生物試樣抗氧化能力的定量測定。該法主要是利用DPPH·中存在單電子，在醇溶液中能形成穩(wěn)定的含氮自由基并呈典型紫色，在517nm處有強吸收的特點，當有自由基清除劑存在時，孤對電子配對，從而使溶液的紫色消退、吸收減弱，變化程度與其接受的電子數(shù)量成定量關系［12］。DPPH法可用分光光度計進行快速的定量分析，在體外檢測抗氧化劑清除自由基方法中最為常見，可用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價［13］。

從圖2可以看出，隨著亳菊添加濃度的上升，亳菊啤酒對DPPH·的清除率也表現(xiàn)出上升的趨勢，但上升幅度卻在逐漸變緩，亳菊添加濃度為1、2、3、4、5g／L時，亳菊啤酒對DPPH·的清除率分別為對照組的1.58、2.00、2.38、2.53、2.70倍，各濃度間DPPH· 清除 率分別增 加 19.55%、13.97%、12.85%、5.03%、5.59%，且3g／L與4g／L、4g／L與5g／L亳菊啤酒的DPPH·的清除率在統(tǒng)計學上無顯著差異（P＞0.05）。這表明在亳菊添加濃度低于4g／L時，增加亳菊的量可以顯著提高產品對DPPH·的清除效果，但當添加濃度達到4g／L以上，繼續(xù)提高亳菊濃度，對DPPH·清除的意義不大。

圖2 不同亳菊啤酒的DPPH·清除能力

2.3 不同濃度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力

Miller等［14］在1993年發(fā)表了用ABTS法評價樣品抗氧化活性的方法——ABTS在活性氧氧化下生成穩(wěn)定的藍綠色ABTS＋·，在734nm處具有最強吸收，當樣品中存在抗氧化物時，ABTS＋·的產生會被抑制，溶液顏色變淺，吸光值減少，測定此處吸光度的變化，可以表明樣品對ABTS＋·清除能力的強弱。該方法在測定食品和飲料類抗氧化活性中廣泛使用［15］。

不同濃度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力如圖3所示。亳菊啤酒的ABTS＋·清除率隨著亳菊添加濃度的升高而上升，添加濃度為1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒對ABTS＋·的清除能力分別為對照組的1.12、1.28、1.43、1.54和1.63倍，且各組間均存在顯著差異（P＜0.05）。同F(xiàn)RAP法測定的總還原力情況類似，增加亳菊所引起的ABTS＋·清除率的增幅表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當亳菊添加濃度為2g／L時，增幅最大，比1g／L組的清除率提高了3.50%，當亳菊添加濃度達到3、4、5g／L 時，ABTS＋·清除率分別比2、3、4g／L組高了2.29%、2.20%和2.07%?？梢?，當亳菊添加濃度達到4g／L以上，亳菊添加濃度的進一步提升對啤酒總還原力的影響變小。

圖3 不同濃度亳菊啤酒的ABTS＋·清除能力

2.4 不同濃度亳菊啤酒的·OH清除能力

·OH是最活躍的活性分子，也是進攻性最強的化學物質之一，可通過電子轉移、加成以及脫氫等方式與生物體內多種分子作用，導致生物體組織脂質過氧化，蛋白質解聚、聚合，核酸斷裂，多糖解聚，破壞細胞膜的結構與功能，引發(fā)細胞凋亡、壞死和突變，并與腫瘤、輻射損傷等有關，是目前所知活性氧自由基中對生物體毒性最強、危害最大的類型［16－17］，清除·OH能力的強弱可作為評價食品保健功能的重要指標。

從表4可以看出，隨著亳菊添加濃度的上升，亳菊啤酒對·OH的清除能力有了很大的提高，分別為對照組的1.60、2.16、2.47、2.82、3.10倍，且各組間均存在顯著差異（P＜0.05），添加亳菊對提高啤酒·OH的清除具有顯著的促進作用。亳菊添加濃度為1、2、3、4、5g／L的亳菊啤酒，對·OH 的清除率比對照組、1、2、3、4g／L 組分別高了13.96%、12.75%、7.23%、7.89%、6.56%，隨著亳菊添加 濃度的上升，啤酒的·OH清除能力的增長速度在逐漸下降。

圖4 不同濃度亳菊啤酒的·OH清除能力

3 結束語

通過以上研究可以看出，雖然用不同方法評價亳菊啤酒的抗氧化性存在一定的差異，但均反映出添加亳菊水提液制備亳菊啤酒能顯著提高成品啤酒的抗氧化性，并對機體中危害最大的羥自由基清除效果良好。因此，從抗氧化角度來說，亳菊的添加為啤酒增加了保健功能。但同時也注意到，在亳菊添加濃度較低時，增加亳菊對提高成品啤酒抗氧化能力效果良好，但當亳菊濃度達到一定水平后，抗氧化能力的提升速度卻逐漸下降，亳菊添加濃度在2～4 g／L最為適宜。這也與之前的研究［6］“能保證亳菊啤酒質量、風味、適口度并體現(xiàn)菊花清香的亳菊添加量”是基本相符的。

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