姚勇

摘 要：隨著人們生活水平的提高，食品安全問題受到越來越多的重視，在不斷被報(bào)道的食品安全事故中，大腸桿菌是引起這些事件的主要的影響因素之一，是判斷食品污染程度的一個(gè)重要參數(shù)，因此采用快速、可靠、簡便的方法來準(zhǔn)確檢測食品中大腸桿菌數(shù)量是否超標(biāo)是至關(guān)重要的。本文綜述了大腸桿菌的傳統(tǒng)檢測方法以及最新的檢測方法，為食品中大腸桿菌的檢測提供參考。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌 檢測 食品

大腸桿菌是人和動物腸道中最著名的一種細(xì)菌，主要寄生于大腸內(nèi)，約占腸道菌中的1%，是一種兩端鈍圓、能運(yùn)動、無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。大腸桿菌能合成維生素B和K，正常棲居條件下不會致??；若進(jìn)入膽囊、膀胱等處可引起炎癥。在水和食品中檢出，可認(rèn)為是被糞便污染的指標(biāo)。大腸菌群數(shù)常作為飲水、食物或藥物的衛(wèi)生學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。大腸桿菌是國際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測指示茵，因此大腸桿菌的檢測技術(shù)顯得十分重要，相應(yīng)出現(xiàn)了大量的大腸桿菌的各種檢測方法[1-2]。以下綜述了一些常用的大腸桿菌檢測的傳統(tǒng)方法以及最近出現(xiàn)的新的檢測方法，為以后大腸桿菌檢測技術(shù)的發(fā)展提供一些參考。

1 大腸桿菌檢測的傳統(tǒng)方法

1.1 多管發(fā)酵法

多管發(fā)酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統(tǒng)方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)24h，而后能產(chǎn)生分解熒光底物——葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產(chǎn)物，進(jìn)而使培養(yǎng)基在紫外光照射下產(chǎn)生特征熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數(shù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)估計(jì)。一般涉及以下試驗(yàn)：首先是發(fā)酵，在單料或雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)發(fā)酵；然后是分離培養(yǎng)試驗(yàn)，利用伊紅美藍(lán)培養(yǎng)皿分離；接著是在乳糖發(fā)酵管中進(jìn)行二次發(fā)酵，最后通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等來完成。多管發(fā)酵法對試驗(yàn)條件要求不高，成本低，但是檢測時(shí)間較長，容易受其他條件干擾，進(jìn)而影響到測定結(jié)果的精確度。

1.2 濾膜法

該方法基本步驟是：首先于濾器內(nèi)加入約10mL無菌稀釋水，接著將適量充分混勻的待檢食品的水溶液加入濾器中，進(jìn)行抽濾，快濾完前加少許無菌稀釋水以沖洗濾器內(nèi)壁，使水溶液內(nèi)的細(xì)菌全部集中于濾膜上；用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在M-FC培養(yǎng)基上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜與培養(yǎng)基完全緊貼不能有氣泡，將培養(yǎng)皿緊密蓋好后，置于能準(zhǔn)確恒溫于44.5±0.5℃的恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)24±2h培養(yǎng)，糞大腸菌群呈藍(lán)色或藍(lán)綠色，計(jì)數(shù)此類菌落數(shù)目。對于疑難的菌落，將可疑菌落接種于EC培養(yǎng)液，44.5±0.5℃培養(yǎng)24±2h后觀察是否產(chǎn)氣，以確定此類可疑菌落是否為糞大腸菌群細(xì)菌。然后計(jì)算每升水樣中糞大腸菌群數(shù)的近似值，最終換算成食品中所含大腸桿菌的數(shù)目。

1.3 平板計(jì)數(shù)法

平板法無菌操作用無菌吸管各吸取1mL與乳糖膽鹽發(fā)酵法相同稀釋度的樣液，移入無菌培養(yǎng)皿中，將冷至45℃的COLI ID選擇性顯色培養(yǎng)基約10mL注入培養(yǎng)皿內(nèi)，并迅速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，混合均勻，待凝固后，再次將冷至45℃的培養(yǎng)基約5mL注入培養(yǎng)皿內(nèi)，并迅速搖開使之覆蓋平板表層，待凝固后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿置37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落顏色與形態(tài)，計(jì)數(shù)。每稀釋度平行做2個(gè)培養(yǎng)皿。該方法是將樣本做一定比例的稀釋，其中的微生物被稀釋后分散成單個(gè)細(xì)胞，然后在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)一直到生長成能用肉眼觀察的菌落，最后通過樣本數(shù)量和稀釋度來計(jì)算出單位樣本中的菌數(shù)。

2 大腸桿菌檢測的新技術(shù)

2.1 氣相色譜（GC）和高效液相色譜法（HPLC）

氣相色譜法主要是將大腸桿菌經(jīng)過一系列衍生化的前處理后，為接下來的分析研究提供盡可能多的化學(xué)組分。大腸桿菌的污染程度可以用頂空氣相色譜法來分析，其原理是利用食品密封系統(tǒng)頂部的微生物代謝產(chǎn)物CO2對微生物進(jìn)行分析。這種方法對食品質(zhì)量安全檢測有重大意義。與上述傳統(tǒng)技術(shù)相比，此種方法具有檢測速度快、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。高效液相色譜法（HPLC）主要是根據(jù)離子配對反相層析的原理來分析核酸。HPLC主要是針對DNA片段分離。長鏈DNA所攜帶的磷酸基團(tuán)比較多，因此會有更多的TEAA與之相融合，其在柱內(nèi)停留的時(shí)間增加。因?yàn)橐译婢哂杏H水性，可以通過其而將DNA分離，在具備一定的變性溫度下，可以通過圖譜顯示明顯的吸收峰。該技術(shù)具有準(zhǔn)確度高、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可大大提高工作效率。

2.2 ATP生物發(fā)光技術(shù)

ATP生物發(fā)光技術(shù)是近些年來發(fā)展較快的微生物快速檢測方法。ATP是活細(xì)胞中最普遍的能量代謝產(chǎn)物，為細(xì)胞提供各種生理活動所需的能量，而且其在生物體內(nèi)含量維持在一定的范圍內(nèi)。ATP含量檢測的一種方法是熒光光度法，生物發(fā)光是活細(xì)胞在熒光素酶催化下發(fā)出的熒光。目前使用的熒光素酶主要來源于北美的螢火蟲，相對分子質(zhì)量為62000的蛋白質(zhì)，它可以催化熒光素的氧化反應(yīng)，這種反應(yīng)的終產(chǎn)物不穩(wěn)定，很快分解產(chǎn)生熒光。與傳統(tǒng)檢測方法相比，不同之處在于幾分鐘內(nèi)便可獲得檢測結(jié)果，而且熒光光度計(jì)是便攜式的，使用非常方便，適用于現(xiàn)場檢測，這種技術(shù)可以用于檢測微小的污染物水平以及食品加工設(shè)備及其表面的清潔程度的檢測。

2.3 PCR檢測技術(shù) [3-5]

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)即P C R（polymerase chain reaction），該技術(shù)是在1971年首先被Kleppe等提出，1985年才作為一種檢測方法獲得認(rèn)可。PCR檢測技術(shù)是一種聚合酶鏈反應(yīng)，其采用變性—退火—延伸三個(gè)步驟使DNA基因能夠在體外實(shí)現(xiàn)解旋解鏈，類似于一種體外增加、復(fù)制形式。理論上可在2h內(nèi)將一個(gè)DNA分子擴(kuò)增到106～109倍，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光條帶。

目前PCR技術(shù)廣泛用于生命科學(xué)的許多學(xué)科中。在食品微生物檢測領(lǐng)域，PCR可用于快速檢測食品中的微生物含量。常用的主要有免疫PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量PCR等。史云等建立了用于肉及肉制品中大腸桿菌的兩重PCR檢測方法，但該方法需要較長的時(shí)間的樣品純化處理，且對操作人員的專業(yè)知識的要求也較高。endprint

2.4 生物傳感器檢測技術(shù)[6-7]

生物傳感器主要是以生物化學(xué)傳感技術(shù)為基礎(chǔ)，用抗體、酶、細(xì)胞等作為識別元件，并與信號轉(zhuǎn)換器和電子測量儀聯(lián)合構(gòu)成的一種分析工具。目前已經(jīng)成熟的商品化的傳感器有免疫傳感器、酶傳感器、DNA雜交傳感器、微生物傳感器、分子印跡傳感器等。生物傳感器具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如高靈敏度、高選擇性、較好的穩(wěn)定性、低成本、且能在復(fù)雜的體系中快速在線監(jiān)測?，F(xiàn)在用于信號傳導(dǎo)的方法有表面聲波傳導(dǎo)、電氣化學(xué)方法和光學(xué)傳導(dǎo)法。用于食品微生物檢測的主要是免疫傳感器和基因傳感器，原理是利用DNA雜交和抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行檢測，再將其轉(zhuǎn)換為光信號或電信號并通過儀器放大輸出。生物傳感器的分子識別元件的載體可采用多種材料，利用較多的是光纖、熒光光度計(jì)等。殷涌光等人利用抗體免疫吸附反應(yīng)，采用一次抗體——抗原一二次抗體的夾心法將膠體金復(fù)合抗體作為二次抗體大幅度增加質(zhì)量，并延長膠體金復(fù)合抗體與微生物的結(jié)合過程，放大和穩(wěn)定信號，從而顯著提高檢測精度。

2.5 免疫磁珠技術(shù)（IMS）

免疫磁珠技術(shù)是一種大腸桿菌的分離技術(shù)。其原理是以磁珠為抗體載體，磁珠和大腸桿菌結(jié)合，通過磁力來實(shí)現(xiàn)力學(xué)移動進(jìn)而將大腸桿菌進(jìn)行分離。與其他的細(xì)菌分離方法相比，免疫磁珠技術(shù)在很大程度上提高了樣本中病原性副溶血性弧菌的檢測效率。免疫磁珠技術(shù)可以快速地在不同菌種的樣本中處理不同的微生物，該方法可以大幅度地提升檢測效率。

2.6 自動化儀器

自動免疫測定分析儀誕生于20世紀(jì)70年代。隨著科技的發(fā)展，自動免疫測定分析儀在各領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多，該儀器使用簡單，無太多操作干擾，既省時(shí)省力，又大大提高了檢測的精確度和靈敏度。這種自動酶標(biāo)免疫測試系統(tǒng)目前在國內(nèi)外是酶免疫自動化系統(tǒng)中應(yīng)用最為廣泛的一種。但是由于與其配套的試劑昂貴，從而限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室的使用。

2.7 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)（gene chip）是20世紀(jì)90年代興起的生物技術(shù)，也叫DNA微陣列（DNA mi—croarray）。采用原位合成（in situ synthesis）或顯微打印方法，將數(shù)以萬計(jì)的DNA探針固化在支持物表面，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，接著與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號來實(shí)現(xiàn)對生物樣品快速、并行、高效地檢測，由于它常用硅芯片作為固相支持物，而且制備中運(yùn)用了計(jì)算機(jī)芯片的制備技術(shù)，所以稱為基因芯片技術(shù)。基因芯片可以對食品中的致病菌實(shí)行高通量和平行檢測，一次實(shí)驗(yàn)就可以得出全部檢測結(jié)果。另外整個(gè)檢測在很短時(shí)間內(nèi)即可得出檢測結(jié)果，且敏感性高，特異性強(qiáng)。但是也有一些問題：目前的基因芯片一般都采用熒光標(biāo)記，因此需要昂貴的芯片制作系統(tǒng)以及激光共聚焦掃描儀，另外操作過程對工作人員要求有很高的專業(yè)素質(zhì)等等。所以基因芯片的制備技術(shù)限制其應(yīng)用而且還需改進(jìn)。

結(jié)語

近年來，世界各國針對水環(huán)境和食品中大腸桿菌的快速檢測技術(shù)展開了大量研究，本文綜述了近年來常用的一些檢測方法，每種方法都有自己的優(yōu)勢以及不足之處。隨著科學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，對食品中大腸桿菌的檢測精度和速度提出了更高的要求，我們只有不斷的改進(jìn)以及完善相關(guān)的檢測技術(shù)，才能適應(yīng)時(shí)代的要求，才能切實(shí)的解決食品安全問題，為人類的生活提供有力保障。

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