張?chǎng)斡?，左偉勇，朱善元，夏曉莉，孫懷昌*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由ASF病毒(ASFV)引起的一種家豬和野豬的烈性傳染病，具有死亡率高和傳播迅速的特點(diǎn)，給疫區(qū)國(guó)家造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病最早發(fā)現(xiàn)于肯尼亞[2]，隨后逐漸在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個(gè)國(guó)家傳播，并有繼續(xù)蔓延的趨勢(shì)[3]。近幾年來，我國(guó)周邊國(guó)家格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯等國(guó)先后發(fā)生多起ASF疫情[4]，但我國(guó)暫未發(fā)現(xiàn)ASF，因而建立有效的檢測(cè)方法對(duì)防止該病進(jìn)入國(guó)內(nèi)具有重要意義。

OIE推薦的ASF實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法有病毒分離、PCR、ELISA和熒光抗體試驗(yàn)等[5]，這些診斷方法一般限制在ASFV參考實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。Beggs等首次用膠體金快速免疫層析法(GICA)測(cè)定人絨毛膜促性腺激素[6]，后來逐步應(yīng)用到微生物病原、抗體的快速檢測(cè)[7-8]，該方法具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)，尤其適合臨床的快速診斷。ASFV E183L基因編碼的p54蛋白存在于病毒粒子內(nèi)層囊膜，參與病毒的吸附與進(jìn)入[9-10]，該蛋白可以刺激機(jī)體產(chǎn)生具有一定中和能力的抗體[11]，可以作為ASFV抗體診斷抗原[12]。本研究將表達(dá)的重組p54蛋白標(biāo)記上膠體金顆粒，制備了一種ASFV抗體快速檢測(cè)膠體金試紙，在5 min～10 min內(nèi)可以判定結(jié)果，適合臨床ASF血清學(xué)快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及生豬國(guó)際貿(mào)易檢疫檢驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 pET-30a(+)表達(dá)載體購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)購自海基生物科技有限公司；pGEX-4T-1-E183L由葡萄牙Gulbenkian de Ciência研究所RM Parkhouse博士惠贈(zèng)；豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)抗體陽性血清均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所丁家波博士惠贈(zèng)；ASFV抗體陽性和陰性豬血清、ASFV診斷抗原(ASF AG CYTO-SOL 92/1)由英國(guó)Pirbright研究所OIE ASF參考實(shí)驗(yàn)室提供；所有工具酶購自TaKaRa公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗豬IgG(IgG-HRP)、氯金酸(HAuCl4)、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄球菌A蛋白(SPA)、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；His親和層析凝膠購自Qiagen公司；CN1403硝酸纖維素膜購自Sartorius公司；硬質(zhì)塑料底板、黏附吸水濾紙、玻璃纖維素膜以及塑料殼購自上海杰一生物技術(shù)有限公司；XYZ3060膠體金點(diǎn)樣系統(tǒng)為Biodot公司產(chǎn)品；2月齡姜曲海豬由江蘇省畜牧獸醫(yī)技術(shù)學(xué)院種豬場(chǎng)提供。

1.2 p 54基因片段亞克隆 利用DNAStar軟件包中Protean軟件對(duì)Ba71V株ASFV p54氨基酸序列進(jìn)行分析，表明其前50個(gè)氨基酸為疏水性氨基酸集中區(qū)，不僅無潛在的B細(xì)胞表位，而且可能影響其在原核細(xì)胞中可溶性表達(dá)。從編碼第51個(gè)氨基酸DNA序列(GenBank FJ174390)開始，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物：正向引物：5-TAGAATTCCTATTCTCTTCA AGAAAG-3；反向引物：5-TACTCGAGTTACAAGG AGTTTTCTAGG-3。

以質(zhì)粒pGEX-4T-1-E183L為模板，擴(kuò)增的p54基因片段(402 bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后，連入載體pET-30a(+)，獲得重組質(zhì)粒pETE183L，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。

1.3 重組p 54蛋白表達(dá)、純化及鑒定 按照文獻(xiàn)[13]中的方法進(jìn)行重組蛋白p54的誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波破碎裂解細(xì)菌，SDS-PAGE對(duì)表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行初步鑒定。

按照Qiagen公司說明書，用His親和層析凝膠純化表達(dá)的重組蛋白，ND-1000紫外分光光度計(jì)定量蛋白，并用0.01 M pH7.4 PBS調(diào)整最終濃度為1 mg/mL。SDS-PAGE分析重組蛋白的純度。

以ASFV抗體陽性豬血清為一抗(1∶200)，以羊抗豬 IgG-HRP 為二抗(1∶10000)，western blot鑒定純化的重組蛋白。

1.4 抗p 54重組蛋白多抗制備 將1 mg純化的重組p54蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合，乳化，肌肉注射2月齡姜曲海豬；免疫后第11 d，肌肉注射同樣劑量弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白；10 d后加強(qiáng)免疫1次。加強(qiáng)免疫后第7 d，無菌采集豬血，分離血清，以5 μg/mL重組蛋白p54包被酶標(biāo)板，與連續(xù)10倍稀釋的豬血清進(jìn)行間接ELISA，測(cè)定p54蛋白抗體的ELISA效價(jià)，同時(shí)設(shè)立陰性豬血清對(duì)照。飽和硫酸銨法沉淀免疫血清中的IgG，PBS 4℃透析過夜，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，-20℃保存。

1.5 重組p 54蛋白膠體金標(biāo)記

1.5.1 膠體金溶液制備 用超純水配制0.01%HAuCl4溶液和1%枸櫞酸三鈉溶液，0.45 μm濾膜過濾配制的溶液，去除其中的聚合物以及其他可能混入的雜質(zhì)，參照文獻(xiàn)[14]制備直徑為20 nm的膠體金。

1.5.2 重組p54蛋白預(yù)處理 PBS 4℃透析處理制備的p54重組蛋白，再用0.005%pH7.0的NaCl溶液4℃透析，除去蛋白中的高濃度鹽離子。10000×g 4℃離心1 h，去除蛋白聚合物。

1.5.3 重組p54蛋白膠體金標(biāo)記及純化 參照文獻(xiàn)[15]，確定重組蛋白p54標(biāo)記膠體金時(shí)的最佳pH以及最佳蛋白標(biāo)記劑量。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，10 mL膠體金溶液中加入適量重組p54蛋白溶液，繼續(xù)攪拌30 min；緩慢加入適量的10%BSA，使其終濃度為1%，攪拌30 min；1200×g 4℃離心15 min，取上清液；12000×g 4℃離心30 min，棄上清液，沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH9.2硼酸鹽緩沖液(含5%蔗糖、1%BSA、0.5%Tween-20、0.2%PEG20000以及0.02%疊氮鈉)懸浮。

1.6 試紙制備及判定

1.6.1 試紙組裝 采用XYZ3060膠體金點(diǎn)樣系統(tǒng)以2 μL/cm的噴量在玻璃纖維膜金標(biāo)墊上均勻噴涂濃度為0.3 mg/mL金標(biāo)抗原，37℃烘箱干燥1 h；以1 μL/cm噴量在硝酸纖維素膜噴涂 1 mg/mL SPA、0.5 mg/mL抗p54 IgG，分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，兩者線間距為5 mm，干燥后切割成4 mm寬的硝酸纖維素膜條，進(jìn)行組裝[16]，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn) 吸取40 μL稀釋的血清，滴加于膠體金試紙的加樣孔中，室溫靜置5 min～10 min，判定結(jié)果。質(zhì)控線和檢測(cè)線均出現(xiàn)紅色條帶為陽性；質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，檢測(cè)線處無紅色條帶為陰性；質(zhì)控線無紅色條帶則該試紙失效。

1.7 特異性試驗(yàn) 用制備的膠體金試紙檢測(cè)已知的CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2以及ASFV抗體陽性豬血清，并根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1.8 敏感性試驗(yàn) 用PBS將制備的抗P54多抗分別稀釋至終濃度1000 ng/mL、800 ng/mL、600 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL，取 40 μL 上述稀釋液滴加于試紙的加樣孔中，室溫靜置5 min～10 min，肉眼觀察并判定結(jié)果。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次及3個(gè)不同批次制備的膠體金試紙對(duì)10份ASFV抗體陽性和10份ASFV抗體陰性的豬血清進(jìn)行檢測(cè)，并比較檢測(cè)結(jié)果。

1.10 試紙比對(duì)試驗(yàn) 將ASFV診斷抗原以23 μg/mL濃度包被酶標(biāo)板，OIE間接ELISA[6]檢測(cè)141份待檢豬血清，其中26份為健康豬血清，24份為ASFV弱毒OURT88/3接種后第13 d的豬血清，34份為ASFV強(qiáng)毒(ASFV OURT88/1、Benin以及Georgia)攻毒后存活下來豬的血清，57份為剛果民主共和國(guó)疫區(qū)豬血清；同時(shí)采用western blot以及膠體金試紙對(duì)上述血清進(jìn)行驗(yàn)證，比較3種方法的檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 p 54基因亞克隆 PCR擴(kuò)增編碼ASFVp54(aa 51～aa 183)基因，將其連入載體pET-30a(+)，采用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pET-E183L構(gòu)建正確(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pET-E183L鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of recombinant plasmid of pET-E183L

2.2 重組p 54蛋白表達(dá)、純化及鑒定 pET-E183L/BL21重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，表達(dá)了約為21 ku的重組蛋白；親和層析法純化表達(dá)的重組蛋白，經(jīng)分析，純化后的重組蛋白純度達(dá)94%；western blot試驗(yàn)表明，該蛋白能夠與ASFV抗體陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2)。

圖2 純化的重組p54蛋白western blot鑒定Fig.2 Identification of purified p54 by western blot

2.3 重組p 54蛋白多抗制備 將制備的重組p54蛋白免疫健康豬3次，分離豬血清，間接ELISA測(cè)定p54抗體，結(jié)果顯示制備的多抗與重組蛋白反應(yīng)良好，效價(jià)達(dá)到 1∶106。

2.4 重組p 54蛋白膠體金標(biāo)記 對(duì)膠體金標(biāo)記條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明最佳標(biāo)記pH為8.0，最佳蛋白標(biāo)記濃度為5 μg/mL。

2.5 特異性試驗(yàn) 用制備的膠體金試紙對(duì)CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2以及ASFV抗體陽性豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅ASFV抗體陽性豬血清呈陽性反應(yīng)，而其他血清均呈陰性反應(yīng)(圖3)，表明該方法具有高度的特異性。

圖3 膠體金試紙?zhí)禺愋栽囼?yàn)Fig.3 Specificity of the colloidal gold strips

2.6 敏感性比較試驗(yàn) 將制備的抗P54多抗梯度稀釋后，分別用膠體金試紙進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示當(dāng)稀釋至200 ng/mL時(shí)，結(jié)果仍呈陽性，而100 ng/mL時(shí)呈陰性(圖4)。

圖4 膠體金試紙敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity of the colloidal gold strips

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 用同一批次和不同批次膠體金試紙對(duì)10份ASFV抗體陽性和10份ASFV抗體陰性豬血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，批內(nèi)及批間檢測(cè)符合率為100%。

2.8 試紙條比對(duì)試驗(yàn) 采用OIE ELISA、western blot以及膠體金試紙條對(duì)26份健康豬血清、24份ASFV弱毒免疫后第13 d采集的豬血清、34份ASFV強(qiáng)毒攻毒后存活豬血清以及57份剛果民主共和國(guó)疫區(qū)豬血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表1。以western blot為參照標(biāo)準(zhǔn)，OIE ELISA和膠體金試紙條檢測(cè)剛果民主共和國(guó)的豬血清與其陽性符合率分別為87.5%(42/48)和 91.7%(44/48)。

表1 不同ASFV抗體檢測(cè)方法比對(duì)Table 1 Comparison of different methods in detecting antibodies to ASFV

3 討 論

由于ASF可以感染各種年齡段的家豬和野豬，并且目前沒有預(yù)防該病的疫苗，因此快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法是防止該病擴(kuò)散蔓延的重要手段之一。OIE規(guī)定的檢測(cè)方法主要包括兩方面：一是病原檢測(cè)，這需要特定的儀器設(shè)備和專業(yè)的技術(shù)人員；二是血清學(xué)檢測(cè)，在ASF流行疫區(qū)和低毒力ASFV初期感染的地區(qū)，血清學(xué)方法是首推的診斷方法，其中最常用的是間接ELISA，所用包被抗原為病毒感染細(xì)胞的裂解物[5]，在制備抗原時(shí)，有散毒的風(fēng)險(xiǎn)，診斷陽性的血清還需用其他的免疫學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

膠體金免疫層析技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一項(xiàng)診斷技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度和特異性高、攜帶方便、肉眼直接觀察等優(yōu)點(diǎn)，與ELISA方法相比，更適合臨床和基層單位的使用。前期研究表明，ASFV感染后，結(jié)構(gòu)蛋白p54激發(fā)豬體產(chǎn)生的抗體時(shí)間較早，抗體滴度高(數(shù)據(jù)尚未公開)，而SPA又可以與豬IgG及部分IgM結(jié)合。在此基礎(chǔ)上制備了以重組p54蛋白(aa 51～183 aa)為抗原，SPA捕捉膠體金標(biāo)記的p54抗原抗體復(fù)合物為檢測(cè)系統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙。通過對(duì)常見豬源CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2抗體陽性的豬血清檢測(cè)，表明制備的膠體金試紙具有特異性良好，批內(nèi)、批間重復(fù)性高的特點(diǎn)。

用該膠體金試紙檢測(cè)ASFV弱毒免疫后第13 d的豬血清，抗體檢測(cè)陽性率為100%，而OIE ELISA檢出陽性率為33.3%。Gallardo等認(rèn)為這是由于待檢血清保存不善造成的[17]，本實(shí)驗(yàn)中所用的血清保存了約兩年，抗體滴度可能有所下降，從而導(dǎo)致ELISA檢測(cè)敏感性降低；另外，最主要的是OIE ELISA包被的抗原為ASFV病毒感染細(xì)胞后提取的可溶性成分，在實(shí)際檢測(cè)中背景值較高，對(duì)于一些抗體滴度較低的血清樣品，高的背景值會(huì)影響陰性臨界值的確定，造成檢測(cè)結(jié)果的假陰性，OIE也認(rèn)為用表達(dá)純化的蛋白作為ELISA包被抗原，檢測(cè)效果會(huì)更好[5,17]。在檢測(cè)ASFV抗體陰性和強(qiáng)陽性豬血清時(shí)，試紙條與OIE ELISA、western blot結(jié)果完全一致；對(duì)來自剛果民主共和國(guó)疫區(qū)幸存豬ASFV抗體檢測(cè)時(shí)，膠體金試紙檢測(cè)陽性率高于OIE ELISA和 western blot， 以 western bolt檢測(cè)結(jié)果為參照，膠體金試紙檢測(cè)符合率更高。上述結(jié)果表明，所制備的膠體金檢測(cè)試紙條比OIE ELISA具有更高的檢測(cè)準(zhǔn)確性，尤其在ASFV感染早期的檢測(cè)。

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