席 娜，趙國(guó)輝，孫恩成，秦永麗，孫 亮，魏 天，徐青元，楊 濤，孫 晶，劉二戰(zhàn)，錢愛(ài)東，吳東來(lái)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150001)

藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是一種由呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬的BT病毒(BTV)引起的，通過(guò)庫(kù)蠓等昆蟲(chóng)傳播的非接觸性反芻動(dòng)物傳染病，主要感染反芻類動(dòng)物，動(dòng)物感染BTV的平均死亡率為30%，綿羊高達(dá)80%[1]。OIE將其列為須通報(bào)疾病，我國(guó)規(guī)定為一類動(dòng)物疫病。BT流行廣泛，目前尚無(wú)有效治療方法[2]，由于BT血清型眾多，新的血清型不斷出現(xiàn)，目前已發(fā)現(xiàn)26個(gè)血清型[3-4]，各血清型之間交叉保護(hù)免疫性差，因此預(yù)防該病的關(guān)鍵是建立快速的血清型檢測(cè)方法。2006年以來(lái)，BTV8在德國(guó)、法國(guó)、荷蘭、比利時(shí)等歐洲國(guó)家暴發(fā)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前還未有BTV8在我國(guó)流行的相關(guān)報(bào)道，因此，必須加強(qiáng)我國(guó)BTV尤其是BTV8相關(guān)工作的研究。

BTV基因組由10個(gè)線性雙股正鏈RNA節(jié)段組成，外殼由L2和M5基因編碼的VP2和VP5組成，占病毒總量的40%，其中VP2是主要型特異性抗原，大多數(shù)能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的抗原表位都存在于VP2蛋白上，并且具有與受體結(jié)合以及凝集紅細(xì)胞作用[5]。本實(shí)驗(yàn)利用真核表達(dá)的重組BTV8 VP2蛋白制備了特異性單克隆抗體(MAb)，并對(duì)其抗原表位進(jìn)行了鑒定，為BTV8型特異性檢測(cè)方法的建立和VP2蛋白結(jié)構(gòu)和功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、病毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SP2/0細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞、Sf21細(xì)胞、E.coliDH10bac感受態(tài)細(xì)胞、BTV1～24型病毒株、茨城病毒、中山病毒、赤羽病毒及抗西尼羅病毒NS1蛋白MAb 4D1均由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；6周齡～10周齡的SPF級(jí)BALB/c雌鼠由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 pFastBacHTA供體質(zhì)粒、抗BTV8型綿羊陽(yáng)性血清均由本研究室保存；ExTaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；T4 DNA連接酶、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗His標(biāo)簽MAb購(gòu)自NEB公司；Cellfectin Reagent轉(zhuǎn)染試劑、MAb亞型鑒定試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、羊抗鼠IgG-HRP購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠 IgG-FITC、驢抗綿羊 IgG-HRP、鄰苯二胺(OPD)均購(gòu)自GIBCO公司；弗氏佐劑、PEG、HAT、HT和8-氮鳥(niǎo)嘌呤(8-AG)均購(gòu)自SIGMA公司。

1.3 BTV8VP 2蛋白的真核表達(dá) 根據(jù)GenBank中登錄的BTV8 L2基因序列(AJ585129)，利用Primer 5.0軟件選取其ORF在5'端和3'端分別設(shè)計(jì)上、下游引物，引物由Invitrogen公司合成。其序列為：VP2-F：5'-CGGGATCCATGGAGGAGCTAGCAATT C-3'(BamHⅠ)，VP2-R：5'-GTCAAGCTTCTATACA TTGAGCAGRTTAG-3'(Hind Ⅲ)。

提取病毒基因組，PCR擴(kuò)增獲得L2全長(zhǎng)基因，雙酶切目的片段VP2和供體質(zhì)粒pFastBacHTA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFast-VP2，并將其轉(zhuǎn)化至DH10Bac，提取重組桿粒BAC-VP2，按照Bac-to-Bac說(shuō)明書(shū)方法在脂質(zhì)體Cellfectin Reagent作用下將重組桿粒BAC-VP2轉(zhuǎn)染Sf21昆蟲(chóng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的Sf21細(xì)胞經(jīng)SDS-PAGE分析，并以HRP標(biāo)記的抗His標(biāo)簽的MAb為一抗，進(jìn)行western blot鑒定檢測(cè)VP2蛋白的表達(dá)及其生物活性。

1.4 重組VP 2蛋白純化 以SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)[6]，利用常規(guī)包涵體純化方法純化重組VP2蛋白。

1.5 動(dòng)物免疫 以純化的重組VP2蛋白腹腔注射免疫6周齡BALB/c雌鼠6只，為100 μg/只，間隔兩周免疫一次。首免以弗氏完全佐劑乳化，二免和三免以弗氏不完全佐劑乳化，三免后一周尾靜脈采血，將血清倍比稀釋，利用純化的重組VP2蛋白包被的ELISA板檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選擇血清效價(jià)最高的小鼠于融合前3 d以100 μg/只VP2蛋白(不加佐劑)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，取其脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.6 間接ELISA檢測(cè)方法的建立 按常規(guī)間接ELISA操作步驟，分別以純化的重組VP2蛋白和野毒桿狀病毒感染的Sf21細(xì)胞作為抗原包被，陰陽(yáng)性血清為一抗，經(jīng)方陣法確定抗原抗體最佳稀釋倍數(shù)，判定標(biāo)準(zhǔn)為，陽(yáng)性血清孔OD492nm值約為1.0，陰性血清孔OD492nm值<0.2，P/N>2.1的最大稀釋度為其最適工作濃度[7]。

1.7 雜交瘤細(xì)胞株的建立及MAb的制備 將SP2/0細(xì)胞與效價(jià)最高小鼠的脾細(xì)胞以1∶4混合，加入融合劑PEG進(jìn)行融合[6]。選擇陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行克隆純化，直到篩選出穩(wěn)定分泌特異性MAb的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并將細(xì)胞凍存。

1.8 MAb的鑒定

1.8.1 間接免疫熒光(IFA)鑒定 將BTV1～24型病毒株、茨城病毒、中山病毒和赤羽病毒分別接種BHK-21細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后用預(yù)冷的75%乙醇4℃固定30 min，以MAb為一抗，羊抗鼠IgG-FITC(1∶50)為二抗，同時(shí)設(shè)立未接病毒細(xì)胞空白對(duì)照及陰、陽(yáng)性血清對(duì)照，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.8.2 MAb的western blot鑒定 將感染BTV8的細(xì)胞沉淀和BHK-21細(xì)胞沉淀處理后進(jìn)行SDS-PAGE轉(zhuǎn)印硝酸纖維素膜，分別以MAb 2G4和3B7作為一抗，羊抗鼠IgG-HRP作為二抗，DAB顯色試劑盒顯色，進(jìn)行western blot分析。

1.8.3 MAb腹水的制備 選取10周齡BABL/c小鼠腹腔注射滅菌液體石蠟0.5 mL/只，7 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，密度為1×106個(gè)/mL～2×106個(gè)/mL，1 mL/只，待小鼠腹部膨大收集腹水。

1.8.4 MAb與腹水效價(jià)測(cè)定以及免疫球蛋白亞類鑒定 將MAb分別做 10×21～10×28倍稀釋及腹水分別做101～108倍稀釋作為一抗，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性血清對(duì)照，利用已建立的間接ELISA方法測(cè)定其效價(jià)。采用MAb亞型鑒定試劑盒進(jìn)行亞類鑒定。

1.8.5 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢測(cè) 將凍存3個(gè)月的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇連續(xù)多次傳代，檢測(cè)其上清液的抗體效價(jià)，鑒定其分泌抗體的穩(wěn)定性。

1.9 抗原表位的鑒定 將VP2蛋白截短為相互重疊6個(gè)氨基酸的96條短肽，分別以100 ng/孔包被ELISA反應(yīng)板，以制備的2株MAbs為一抗，羊抗鼠IgG-HRP為二抗進(jìn)行間接ELISA鑒定，同時(shí)HRP標(biāo)記的MBP MAb作為陽(yáng)性對(duì)照，以抗西尼羅病毒NS1蛋白MAb 4D1作為陰性對(duì)照，根據(jù)OD492nm值初步鑒定VP2的抗原表位，對(duì)鑒定出的線性表位利用NCBI Blast進(jìn)行同源性比較。

2 結(jié) 果

2.1 VP 2蛋白在桿狀病毒中的表達(dá)及純化 重組供體質(zhì)粒pFast-VP2經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定得到兩個(gè)片段，與預(yù)期大小4856 bp和2886 bp相符(圖略)，測(cè)序結(jié)果正確。采用通用M13上下游引物和特異性親本上下游引物對(duì)所提取的重組桿粒BAC-VP2進(jìn)行PCR鑒定，分別擴(kuò)增出大小約5300 bp和2900 bp的片段，與預(yù)期大小相符(圖略)。利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出BTV8重組蛋白VP2，通過(guò)包涵體純化方法對(duì)其進(jìn)行了純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，VP2蛋白在Sf21細(xì)胞株得到表達(dá)，其分子量約為110 ku，大小與預(yù)期相符(圖1A)。Western blot結(jié)果顯示該蛋白可以與抗BTV8綿羊陽(yáng)性血清產(chǎn)生反應(yīng)，顯示出良好的抗原性(圖1B)。

圖1 重組VP2蛋白SDS-PAGE(A)分析及western blot(B)鑒定Fig.1 The analysis of recombinant protein VP2 by SDS-PAGE(A)and western blot(B)

2.2 間接ELISA方法的建立 經(jīng)方陣法測(cè)定間接ELISA最佳反應(yīng)條件為：VP2蛋白和野毒桿狀病毒感染的Sf21細(xì)胞分別做1∶500稀釋即每孔約為100 ng，5%脫脂乳4℃封閉過(guò)夜，陰陽(yáng)性血清1∶2000稀釋，羊抗鼠IgG-HRP二抗工作濃度1∶5000時(shí)，作用條件均為37℃孵育1 h，底物顯色時(shí)間為10 min，可以用于陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的篩選。

2.3 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的獲得及MAb的制備 免疫的BALB/c鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合后，經(jīng)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)3次細(xì)胞克隆純化后，得到2株穩(wěn)定分泌抗BTV8 VP2蛋白MAb的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，命名為2G4和3B7。

2.4 MAb的鑒定

2.4.1 IFA鑒定 分別利用2株MAbs對(duì)接種BTV1～24，茨城病毒，中山病毒和赤羽病毒的BHK-21細(xì)胞及未接種病毒的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗(yàn)，結(jié)果顯示2G4和3B7均僅與BTV8發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)，與其他血清型BTV以及茨城病毒，中山病毒和赤羽病毒均呈陰性反應(yīng)(圖2)，表明這2株MAbs具有較強(qiáng)的特異性。

圖2 MAbs與BTV8的IFA試驗(yàn)Fig.2 IFA assay of MAbs reaction with BTV8 infected cells

2.4.2 MAb的western blot鑒定 利用western blot鑒定這2株MAbs，結(jié)果顯示其與真核表達(dá)的VP2蛋白、BTV8病毒呈陽(yáng)性反應(yīng)，在110 ku處出現(xiàn)特異性條帶(圖3)，而與野生型桿狀病毒表達(dá)蛋白、BHK-21細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，證明這2株MAbs與BTV8 VP2蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。

圖3 MAb的western blot鑒定Fig.3 Identification of the MAbs by western blot

2.4.3 MAb與腹水效價(jià)測(cè)定以及免疫球蛋白亞類鑒定 經(jīng)間接ELISA測(cè)定MAb 2G4和3B7雜交瘤細(xì)胞上清液的效價(jià)分別為1∶1280、1∶5120，腹水效價(jià)分別為 1∶105、1∶106。2G4 和 3B7 亞類均為 IgG1/κ 鏈。

2.4.4 雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性檢測(cè) 將凍存3個(gè)月的2G4和3B7雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇后，多次連續(xù)傳代收集培養(yǎng)上清液進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示2株MAbs的OD492nm值未發(fā)生明顯變化，表明2G4和3B7均能夠穩(wěn)定分泌特異性MAb。

2.5 抗原表位的鑒定 將VP2蛋白截短表達(dá)，以2株MAbs為一抗，ELISA試驗(yàn)初步鑒定2G4的抗原表位位于短肽VP2-29上，抗原表位定位到281LCRLLSTIGRKMCNTE296(圖 4)，而 3B7與96條短肽均不發(fā)生反應(yīng)，推測(cè)3B7可能為構(gòu)象表位。利用BLAST對(duì)2G4抗原表位進(jìn)行保守性分析，結(jié)果顯示所鑒定的BTV8 VP2蛋白的抗原表位在不同地域來(lái)源的BTV8病毒株中完全保守。此外，比對(duì)結(jié)果還表明2G4的抗原表位與BTV3、BTV13、BTV18和BTV23相對(duì)應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列的同源性較大，而與其他血清型病毒株差異顯著，同源性低。

圖4 合成短肽的間接ELISA分析Fig.4 Analysis of synthetic short peptides by indirect ELISA

3 討 論

BTV呈蔓延趨勢(shì)，不斷有新地區(qū)發(fā)生疫情[8]。BTV具有多型性，當(dāng)前已存在26個(gè)血清型，不同血清型之間無(wú)交叉免疫力，因此防控BTV的重要措施是建立型特異性鑒別診斷方法。本研究制備的這兩株針對(duì)BTV8 VP2蛋白MAbs，只與BTV8發(fā)生特異性反應(yīng)，而與BTV其他血清型、茨城病毒、中山病毒和赤羽病毒不發(fā)生反應(yīng)，為BTV8型特異性MAbs。為進(jìn)一步鑒定這兩株MAbs所識(shí)別的B細(xì)胞抗原表位，通過(guò)原核表達(dá)的96條覆蓋VP2全長(zhǎng)的連續(xù)重疊的MBP融合短肽初步斷定MAbs所識(shí)別的抗原表位，獲得一個(gè)新型線性表位。通過(guò)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明2G4的線性抗原表位在不同地區(qū)來(lái)源的BTV8病毒株中是高度保守的，同時(shí)，比對(duì)結(jié)果還表明與 BTV3、BTV13、BTV18和BTV23相對(duì)應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列的同源性較大，而與其他血清型病毒株以及呼腸孤病毒科環(huán)狀病毒屬內(nèi)的代表病毒之間差異顯著，這與Maan等研究表明BTV8、BTV18和BTV23以及BTV3和BTV13均具有相同的核酸型是一致的[9]。所鑒定的這個(gè)線性B細(xì)胞表位為BTV8型特異性抗原表位，為標(biāo)記疫苗和型特異性診斷方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

利用MAbs鑒定抗原表位已成為研究蛋白結(jié)構(gòu)功能的重要工具[10]，本研究中也通過(guò)DNAStar軟件對(duì)BTV8 VP2蛋白結(jié)構(gòu)做了初步分析，顯示這個(gè)線性表位區(qū)域具有較高的抗原指數(shù)，但是親水性和表面呈現(xiàn)指數(shù)偏低，為BTV8 VP2蛋白的立體結(jié)構(gòu)特性和功能的研究提供參考數(shù)據(jù)，也有利于表位疫苗的研制。

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