吳 丹 ，聶燕釵 ，曹 禹 ，曹 淵 ，周懷谷

（1.上海市公安局物證鑒定中心 法醫(yī)物證學(xué)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200083；2.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院，上海 200032；3.無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫 214174）

人類(lèi)線粒體DNA（mtDNA）是位于細(xì)胞核以外的唯一基因組DNA，具有突變率高、遵循母系遺傳的特點(diǎn)，與每個(gè)體細(xì)胞核DNA只有兩個(gè)拷貝相比，其mtDNA則有成百上千個(gè)拷貝，因此，對(duì)那些因微量、降解、腐敗等原因而造成核DNA分型失敗的生物檢材進(jìn)行mtDNA檢測(cè)分析成為法醫(yī)物證領(lǐng)域又一重要的技術(shù)手段[1]。同時(shí)，在母系親緣關(guān)系認(rèn)定、大型災(zāi)難調(diào)查、考古研究等方面，mtDNA檢測(cè)分析也顯示出良好的應(yīng)用前景。目前常規(guī)的mtDNA檢測(cè)方法仍然是對(duì)其高變區(qū)的直接測(cè)序，存在步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、測(cè)序區(qū)段有限等缺陷，大大影響了mtDNA在法醫(yī)物證領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。

本研究利用單核苷酸多態(tài)性（SNP）遺傳標(biāo)記分布廣泛、遺傳穩(wěn)定、分析片段短、可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn)[2]，結(jié)合等位基因特異性引物擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)，開(kāi)發(fā)建立一種16個(gè)mtDNA SNP的復(fù)合檢測(cè)體系，對(duì)mtDNA進(jìn)行簡(jiǎn)便、有效的高通量分型提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

50份漢族無(wú)關(guān)個(gè)體FTA卡血液樣本，通風(fēng)干燥處保存。

1.2 主要儀器與試劑

QIAcube多功能全自動(dòng)樣本制備工作站（德國(guó)QIAGEN公司），9700型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)AB公司），7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀（美國(guó)AB公司），3130XL遺傳分析儀（美國(guó)AB公司），Quantifiler DNA定量試劑盒（美國(guó) AB 公司），Wizard?DNA Clean-up System（美國(guó) Promega公司），BigDye Terminator Cycle Sequencing試劑盒（美國(guó)AB公司）。

1.3 提取DNA與定量分析

應(yīng)用QIAcube多功能全自動(dòng)樣本制備工作站提取FTA卡血樣DNA，詳見(jiàn)使用說(shuō)明。所得DNA采用Quantifiler DNA定量試劑盒，7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀和SDS v1.2.3軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 SNP位點(diǎn)的選擇

參考文獻(xiàn)[3]并綜合考慮高變異率、引物設(shè)計(jì)、Tm值等諸多因素，最終確定亞洲人群中多態(tài)性較高的16個(gè)SNP，并以其在mtDNA的序列位置命名，即分別為：152、709、3010、3970、5178、8414、9 bp、9540、10398、10873、12705、13928、14783、15043、16311、16362，其中8281~8289位置堿基序列為CCCCCTCTA，與前面8272~8280的9個(gè)堿基形成重復(fù)，有時(shí)整體缺失，以其序列重復(fù)或缺失分別標(biāo)記為NORM或DEL。

1.5 引物的設(shè)計(jì)與合成

等位基因特異性引物的設(shè)計(jì)：針對(duì)每個(gè)SNP標(biāo)記，設(shè)計(jì)3條引物，2條上游等位基因特異性引物序列3′末端分別與二態(tài)SNP的兩種分型相對(duì)應(yīng)；為限制非特異性延伸，在近其3′端倒數(shù)第3或第4位引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，兩條引物在長(zhǎng)度上相差4 bp，以示區(qū)分；下游為公用引物，并用FAM熒光標(biāo)記。

測(cè)序引物：以300～400bp測(cè)序長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)計(jì)14對(duì)測(cè)序引物，測(cè)序片段覆蓋全部16個(gè)mtDNA SNP標(biāo)記。

引物設(shè)計(jì)采用Premier 5.0和Oliog 6.0軟件完成，由上海Sangon公司合成。

1.6 復(fù)合擴(kuò)增體系的建立

參照理論Tm值，通過(guò)引物濃度配比調(diào)整和優(yōu)化擴(kuò)增條件等手段，最終確定復(fù)合擴(kuò)增體系為10μL，包括反應(yīng)混合液 4μL，引物 2μL，C-Taq（5U/μL） 0.2μL，模板DNA 2μL，補(bǔ)純水至10μL。PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃ 3min；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 20min。

1.7 毛細(xì)管電泳分型檢測(cè)

電泳分析，取PCR產(chǎn)物1μL，mtSNP等位基因分形標(biāo)準(zhǔn)物1μL，分別與AGCU Marker SIZ-500 0.5μL和去離子甲酰胺12 μL混合，95℃變性3 min，冰浴3min，電泳檢測(cè)。

1.8 測(cè)序驗(yàn)證

采用直接測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證。設(shè)計(jì)測(cè)序引物，隨機(jī)抽取5個(gè)樣本，對(duì)16個(gè)SNP位點(diǎn)序列分別進(jìn)行DNA測(cè)序。對(duì)獲得的16個(gè)SNP位點(diǎn)上的對(duì)應(yīng)堿基，與等位基因特異性引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行比較確認(rèn)。

2 結(jié) 果

2.1 16個(gè)mtDNA SNP的復(fù)合擴(kuò)增和分型

采用等位基因特異性引物法，對(duì)50份無(wú)關(guān)個(gè)體樣本DNA進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，9947A作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)毛細(xì)管電泳后，50個(gè)樣本均得到清晰的分型圖譜（圖1）。

圖1 一個(gè)體mtDNA SNP復(fù)合擴(kuò)增毛細(xì)管電泳圖譜

2.2 靈敏度檢測(cè)

采用本檢測(cè)體系，樣本DNA經(jīng)倍比稀釋后，分別進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果顯示本復(fù)合擴(kuò)增體系中，最低檢測(cè)量為0.1pg，當(dāng)模板量在0.5～10pg時(shí)能得到較理想的分型圖譜。

2.3 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果

建立的復(fù)合檢測(cè)體系檢測(cè)結(jié)果與直接測(cè)序法結(jié)果一致（圖 2）。

圖2 直接測(cè)序法圖譜（9bp序列重復(fù)）

3 討 論

SNP是由基因組水平上的單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最能反映群體遺傳結(jié)構(gòu)和個(gè)體間遺傳差異的遺傳標(biāo)記之一。目前已開(kāi)發(fā)的SNP檢測(cè)方法如利用熒光淬滅效應(yīng)和實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)的TaqMan技術(shù)，檢材適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性好，但成本高、探針設(shè)計(jì)難度高[4]；基于引物延伸原理的SNPShot微測(cè)序方法，結(jié)果穩(wěn)定可靠，現(xiàn)在應(yīng)用較多，但是仍然需要進(jìn)行兩步擴(kuò)增反應(yīng)[5]；高通量的檢測(cè)方法有等位基因特異性連接技術(shù)（SNPlex）[6]、基因芯片技術(shù)[7]以及基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）等，這些技術(shù)在應(yīng)用上仍有諸多缺陷，如需要大型專(zhuān)用設(shè)備、花費(fèi)成本過(guò)高、耗時(shí)長(zhǎng)等，不易在一般實(shí)驗(yàn)室普及。

相比較之下，本研究建立的片段差異等位基因特異性引物法，操作簡(jiǎn)便，DNA樣本經(jīng)一步擴(kuò)增后，直接用于毛細(xì)管電泳分型檢測(cè)，在現(xiàn)有的法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室平臺(tái)上就能完成整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程，耗時(shí)短。在特異性引物設(shè)計(jì)中，在其3′端區(qū)域引入一個(gè)錯(cuò)配堿基，大大提高了引物延伸的特異性，降低了SNP分析的假陽(yáng)性率[8]。在本檢測(cè)體系的16個(gè)mtDNA SNP位點(diǎn)上，復(fù)合檢測(cè)體系檢出結(jié)果與直接測(cè)序法結(jié)果完全一致，證明該方法分型結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

與直接測(cè)序法檢測(cè)的僅是線粒體高變區(qū)不同，本研究引入了13個(gè)編碼區(qū)SNP位點(diǎn)，由于編碼區(qū)承受的選擇壓力相對(duì)較大，堿基突變率低，分析編碼區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)無(wú)疑對(duì)法醫(yī)提高排除率起到積極作用[9]。

在建立的10 μL PCR復(fù)合擴(kuò)增體系中，最低檢測(cè)量為0.1 pg細(xì)胞總DNA，當(dāng)模板量在0.5～10 pg時(shí)能得到較理想結(jié)果，與商業(yè)化的STR檢測(cè)試劑盒相比較，由于mtDNA的遺傳特性，本檢測(cè)體系顯示出更高的靈敏度。

綜上所述，本復(fù)合檢測(cè)體系操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好、分型準(zhǔn)確，可作為替代線粒體測(cè)序方法應(yīng)用于法庭科學(xué)檢驗(yàn)，同時(shí)為法醫(yī)微量、降解、無(wú)核檢材的高通量分型提供了新的技術(shù)手段。在后續(xù)研究中，將進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)樣本，并通過(guò)群體遺傳學(xué)調(diào)查，探討其在法庭科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。

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