張艷花，易洪楊，房明，榮廷昭，曹墨菊

四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所，教育部作物基因資源與遺傳改良重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學及遺傳育種重點實驗室，成都 611130

玉米新選細胞質雄性不育系小孢子發(fā)育的細胞學觀察及DNA甲基化分析

張艷花，易洪楊，房明，榮廷昭，曹墨菊

四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所，教育部作物基因資源與遺傳改良重點實驗室，農(nóng)業(yè)部西南玉米生物學及遺傳育種重點實驗室，成都 611130

細胞質雄性不育在高等植物中普遍存在，是雜種優(yōu)勢利用的重要工具，為推動植物雜種優(yōu)勢的利用發(fā)揮了重要作用。文章以本課題組前期新選的玉米細胞質雄性不育系A1、A2及保持系18(紅)為材料，利用石蠟切片技術對不育材料小孢子發(fā)育過程進行細胞學觀察，采用高效液相色譜法(HPLC)對不同發(fā)育時期的葉片及不同發(fā)育時期的雄穗DNA進行甲基化分析，從細胞學和表觀遺傳學角度了解不育系A1、A2的敗育機制。結果表明：不育材料A1、A2小孢子發(fā)生敗育的主要時期為四分體時期至單核小孢子中期。在不育系A2中還存在另一種敗育方式，即在花粉母細胞時期表現(xiàn)出敗育特征。甲基化分析結果表明，保持系18(紅)的葉片DNA甲基化水平從苗期到拔節(jié)期迅速上升，而不育系A1、A2葉片DNA甲基化水平基本保持不變；保持系雄穗DNA甲基化水平表現(xiàn)為從花粉母細胞時期到雙核期逐漸升高，而不育材料A1、A2從花粉母細胞時期到雙核期的雄穗DNA甲基化水平表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢，達到最高峰的時期均出現(xiàn)在小孢子發(fā)育的四分體時期。從小孢子發(fā)育的細胞學觀察結果可以發(fā)現(xiàn)，小孢子敗育的主要時期往往具有較高的甲基化水平，推測DNA甲基化水平變化可能與不育材料A1、A2的花粉敗育有關。

玉米；細胞質雄性不育；細胞學觀察；DNA甲基化

DNA甲基化(DNA methylation)是表觀遺傳學修飾方式之一[1]，是在DNA甲基化轉移酶的作用下將S-腺苷甲硫氨酸的甲基添加到 DNA分子中特定的堿基上的過程[2]。大量研究表明，DNA甲基化在調控基因的時空表達和維持基因組的相對穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用[3,4]。

植物細胞質雄性不育(Cytoplasmic male sterility, CMS)在高等植物中普遍存在，是植物雜種優(yōu)勢利用的主要工具。李娜等[2]研究結果表明，DNA 甲基化表達模式的改變可能會影響植物的育性；盧艷麗等[5]對玉米 CMS-C的研究也表明，CMS可能與雄穗DNA甲基化水平的變化有關。在植物調控基因表達的過程中，DNA甲基化水平的變化對其生長發(fā)育有著至關重要的作用。目前常用的 DNA 甲基化檢測方法有：高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)、甲基化敏感擴增多態(tài)性法(Methylation sensitive amplification polymorphism, MSAP)、SssI甲基轉移酶法、免疫共沉淀測序技術(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing, Me-DIP-seq)、結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(Combined bisulfite restriction analysis, COBRA)、測序法等[6～9]。其中 MSAP法已被廣泛應用于玉米(Zea mays)[10]、水稻(Oryza sativa)[11]、棉花(Gossypium spp)[12]和擬南芥(Arabidopsis thaliana)[13]等植物基因組的胞嘧啶甲基化分析。但是，MSAP技術是利用同裂酶在全基因組范圍內檢測CCGG位點胞嘧啶甲基化水平，不能檢測非CCGG位點的甲基化，在一定程度上低估了基因組胞嘧啶甲基化水平，具有一定的局限性。相比而言，HPLC法能在宏觀上對全基因組的甲基化水平進行大規(guī)模的分析測定，由Kuo等[14]首次報道，被譽為基因組 DNA甲基化檢測中較為標準的方法[15～18]。目前，HPLC法已廣泛應用于動物和微生物DNA甲基化的研究，但在植物中的應用研究相對較少[19,20]，而在玉米上利用HPLC技術檢測DNA甲基化水平的相關研究未見報道。

四川農(nóng)業(yè)大學玉米研究所在玉米轉基因后代中，發(fā)現(xiàn)了兩個雄性不育株。經(jīng)初步觀察發(fā)現(xiàn)，其敗育徹底，且不育性表現(xiàn)穩(wěn)定，命名為A1、A2。徐小遜等[21]、榮鳳軍等[22]通過育性恢復專效性分類方法并結合特異性引物檢測分析，初步將不育材料A1、A2劃分為玉米細胞質雄性不育的C組群。本文將對不育系 A1、A2及保持系 18(紅)的小孢子發(fā)育過程進行細胞學觀察，并利用高效液相色譜法對供試材料的DNA甲基化進行檢測，旨在了解不育材料A1、A2的敗育過程，探討DNA甲基化水平的變化與育性表現(xiàn)的關系。

1 材料和方法

1.1 材料

將不育系A1、A2以及相應的保持系18(紅)播種于四川農(nóng)業(yè)大學溫江試驗基地，常規(guī)田間管理。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制備

選取A1、A2、18(紅) 3個材料的花粉母細胞時期、二分體時期、四分體時期、單核期、雙核期的花藥，用卡諾氏液固定，蘇木精染色，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，樹膠封片，脫蠟，顯微鏡觀察并照相。

1.2.2 玉米基因組DNA的提取

用CTAB法提取A1、A2、18(紅)的苗期和拔節(jié)期葉片基因組DNA以及花粉母細胞時期、四分體時期、單核期、雙核期的雄穗基因組DNA。

1.2.3 HPLC法檢測DNA甲基化

首先將DNA樣品水解成堿基，水解體系為：1 μg DNA 加入50 μL水解混合液(250 UBenzonase、300 mU 磷酸二酯酶 I、200 U 堿性磷酸酶、5 mL pH為7.9的Tris-HCl buffer、100 mmol NaCl、20 mmol MgCl2)。然后以標準品為對照，當水解產(chǎn)物經(jīng)色譜柱時用紫外光測定其吸收峰值，并利用公式：DNA總甲基化水平=5-mC /(C+5-mC)×100%，從而計算出基因組甲基化的整體水平。本實驗所用色譜儀為島津 20A 型高效液相色譜儀；對照胞嘧啶(C)和 5-甲基胞嘧啶(5-mC)標準品，均購自Sigma公司。

2 結果與分析

2.1 細胞學觀察

2.1.1 保持系18(紅)

通過石蠟切片觀察，保持系 18(紅)小孢子發(fā)育過程如圖 1所示，在花粉母細胞進入第一次減數(shù)分裂前期 I時，花粉母細胞正常分裂，體積較大且細胞質較濃。藥壁組織完全分化為絨氈層、中層、藥壁內層以及表皮層，其中最內側的絨氈層發(fā)育正常，細胞體積大且排列緊密；之后花粉母細胞分裂形成2個子細胞，進入二分體時期。在二分體時期藥囊體積逐漸擴大，絨氈層細胞厚度明顯增加且排列整齊；經(jīng)第二次減數(shù)分裂形成四分體，其外周為胼胝質，絨氈層細胞一直處于濃縮狀態(tài)且染色較深；從四分體中游離出來的小孢子通過兩次有絲分裂形成1個營養(yǎng)細胞和 2個生殖細胞，同時內含物逐漸積累，最終形成花粉粒；減數(shù)分裂完成后絨氈層開始逐步解體，為花粉形成和發(fā)育提供營養(yǎng)。

2.1.2 不育材料A1

通過觀察不育材料A1小孢子發(fā)育過程發(fā)現(xiàn)，從小孢子母細胞時期至二分體時期不育材料 A1與保持系 18(紅)的細胞學特征沒有明顯的差別，即花粉母細胞體積較大且細胞質較濃，絨氈層細胞排列整齊。但二分體形成以后花藥小孢子囊開始出現(xiàn)異常，此時絨氈層細胞出現(xiàn)明顯的液泡化，細胞體積變大并輕微的徑向膨脹，同時絨氈層細胞開始脫離花藥壁向內萎縮，而此時小孢子細胞在藥囊中央相互粘連成環(huán)狀，并被向內萎縮逐漸膨大的絨氈層細胞擠壓崩潰。藥囊中小孢子細胞和絨氈層細胞全部解體，表現(xiàn)為無花粉粒的敗育類型(圖2)。

圖1 保持系18(紅)小孢子發(fā)育的細胞學觀察

圖2 不育材料A1小孢子發(fā)育的細胞學觀察

圖3 不育材料A2小孢子發(fā)育的細胞學觀察

2.1.3 不育材料A2

在不育材料 A2中觀察到兩種不同的敗育類型(圖3)。第一種與不育材料A1敗育類型相似，即在四分體時期絨氈層細胞體積變大，出現(xiàn)了明顯的液泡化，并逐漸脫離藥壁向內萎縮擠壓藥囊中的小孢子細胞，最終導致小孢子細胞和絨氈層細胞全部解體，表現(xiàn)為無花粉粒的敗育類型，是主要的敗育方式。第二種類型小孢子敗育發(fā)生較早，在減數(shù)分裂前小孢子母細胞即出現(xiàn)濃縮解體跡象，而絨氈層細胞發(fā)育基本正常。但隨后絨氈層細胞出現(xiàn)明顯的液泡化，徑向厚度也明顯增加，藥室?guī)缀跞勘辉龃蟮慕q氈層細胞占據(jù)，表現(xiàn)為無花粉粒的敗育類型。

2.2 DNA甲基化水平檢測

2.2.1 DNA甲基化的檢測及分析

利用 HLPC法對不育材料 A1、A2及保持系18(紅)的苗期和拔節(jié)期葉片基因組DNA以及花粉母細胞時期、四分體時期、單核期和雙核期的雄穗基因組DNA進行甲基化分析。HLPC分析采用的是本實驗優(yōu)化的色譜條件：C18填料色譜柱(5 μm，250 mm× 4.6 mm)；柱溫箱溫度：35℃，洗脫液：10%甲醇、5 mmol/L的戊烷磺酸鈉、0.2%的三乙胺混合液(pH調至3.5)，流速：0.8 mL/min，檢測波長：273 nm，進樣量：20 μL。根據(jù)甲基化水平的計算公式得出供試材料的DNA甲基化水平，結果見表1。

表1 不同時期玉米基因組DNA甲基化水平

從表1中可以看出，玉米基因組中DNA甲基化水平是一個動態(tài)變化的過程，即在不同組織以及相同組織的不同發(fā)育時期，甲基化水平是不同的。

對不同發(fā)育時期葉片 DNA甲基化水平分析結果如圖4。保持系18(紅)苗期葉片的DNA甲基化水平明顯低于不育系A1、A2；而保持系拔節(jié)期葉片的DNA甲基化水平迅速升高，明顯高于不育材料，但不育系 A1、A2的甲基化水平從苗期到拔節(jié)期卻沒有發(fā)生明顯的變化。

圖4 不同發(fā)育時期葉片DNA甲基化分析

對供試材料不同發(fā)育時期雄穗 DNA進行甲基化分析，結果見圖5。不育材料A1、A2雄穗DNA甲基化水平呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，即由花粉母細胞時期到雙核期 DNA甲基化水平表現(xiàn)為先上升后下降，其最高峰時期為四分體時期。而保持系18(紅)雄穗 DNA甲基化水平表現(xiàn)為從花粉母細胞時期到雙核期逐漸升高；花粉母細胞時期是DNA復制、蛋白質合成以及能量代謝的重要時期，很多基因處于活化狀態(tài)，因此甲基化水平總體較低；隨著小孢子的發(fā)育，很多基因由活化狀態(tài)逐漸轉變?yōu)槌聊?。故甲基化總體水平升高，這與小孢子發(fā)育規(guī)律相吻合。不育材料A1、A2，其四分體時期雄穗DNA甲基化水平明顯高于18(紅)，且四分體時期是其雄穗DNA甲基化水平達到最高峰的時期，這可能是由于某些小孢子正常發(fā)育所需的基因被抑制表達，致使不育材料在四分體時期甲基化水平較高。

圖5 不同發(fā)育時期雄穗DNA甲基化分析

結合細胞學觀察結果，可以發(fā)現(xiàn)不育材料發(fā)生敗育的主要時期即四分體時期，其甲基化水平相對較高，推測可能與一些小孢子正常發(fā)育所需的基因被抑制表達有關，某些關鍵基因的沉默導致代謝紊亂，致使花粉發(fā)育異常。從圖5中也可以看出，不同材料(A1、A2)的花藥，在相同發(fā)育時期其 DNA甲基化水平存在一定差異，這與細胞學觀察結果相吻合，即A1、A2的敗育方式存在差別。

3 討 論

本文通過對小孢子發(fā)育的細胞學觀察，發(fā)現(xiàn)A1、A2的敗育時期主要發(fā)生在四分體至單核小孢子中期。這與陳偉程等[23]報道過的C型細胞質雄性不育系的敗育特征基本一致；也與徐小遜[21]、榮鳳軍[22]等把A1、A2劃分為C型細胞質雄性不育的研究結果相印證，但在不育材料A2中還觀察到另外一種敗育方式，即在花粉母細胞時期表現(xiàn)出敗育現(xiàn)象。羅紅兵等[24]在 GDS型細胞質雄性不育材料中也報道過類似的敗育過程，說明A1、A2之間存在一定差異。

本研究觀察到不育材料絨氈層發(fā)育異常，在四分體時期絨氈層細胞出現(xiàn)明顯的液泡化，徑向厚度增加，并脫離藥壁向內萎縮，擠壓破壞小孢子細胞，最終導致花粉敗育。由此可見，不育材料 A1、A2花藥的敗育與絨氈層的發(fā)育異常有關，這與前人的研究結果類似[25,26]。絨氈層位于花藥壁最內側，其主要功能是為小孢子的形成和發(fā)育提供營養(yǎng)物質，對花粉的形成至關重要。絨氈層細胞正常與否將會直接影響花粉的發(fā)育。

對不同時期的葉片DNA甲基化分析表明，從苗期到拔節(jié)期，保持系葉片DNA甲基化水平迅速上升，表現(xiàn)出成倍的增長，而不育系葉片DNA甲基化水平則保持基本不變。這一差異暗示著不育系和保持系從營養(yǎng)生長向生殖生長轉變過程中基因表達模式可能存在不同。DNA甲基化調節(jié)植物基因的表達，為了維持植物正常的生長發(fā)育，一些基因持續(xù)表達并處于活化狀態(tài)，其DNA甲基化水平較低；而另外一些基因表達受到抑制，則其甲基化水平較高。因此植物基因組 DNA甲基化水平的改變一定程度上反映出基因時空表達模式的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)A1、A2的雄穗DNA甲基化水平均在小孢子發(fā)育的四分體時期達到最高峰，結合前文對小孢子發(fā)育過程的細胞學觀察結果以及前人報道的C型細胞質雄性不育發(fā)生敗育的時期，可以發(fā)現(xiàn)小孢子敗育的主要時期往往具有較高的 DNA甲基化水平。這可能是與不育系在花粉形成過程中的某些關鍵酶或基因的異常表達有關。由此推測，DNA甲基化水平的變化與雄花敗育可能具有某種內在聯(lián)系。本研究為從表觀遺傳學角度探索玉米細胞質雄性不育的發(fā)生機理提供了重要線索。

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(責任編委: 賴錦盛)

Cytological observation and DNA methylation analysis of two new cytoplasmic male sterile lines of maize during microsporogenesis

Yanhua Zhang, Hongyang Yi, Ming Fang, Tingzhao Rong, Moju Cao

Key Laboratory of Crop Genetic Resource and Improvement of Ministry of Education, Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Southwest Region of Ministry of Agriculture, Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China

Cytoplasmic male sterility (CMS) is a widespread phenomenon in higher plants and has been applied in the commercial production of hybrid seeds. Two CMS lines A1 and A2 of maize were obtained previously by a transgenic experiment. In this study, we conducted cytological observation of developmental microspores with CMS lineA1, A2 and their maintainer line (18 red) using paraffin section technology. We also analyzed DNA methylation levels at different developmental stages using high performance liquid chromatography (HPLC). Our results showed that the pollen abortion of A1 and A2 mainly happened from the tetrad stage to the middle of mononuclear stage. Another abortive phenomenon found in CMS line A2 occurred at the pollen mother cell stage. The DNA methylation level of leaf increased rapidly from the seedling stage to the shooting stage in 18 red, while it remained constant in A1 and A2. For the tassel, the DNA methylation levels in 18 red increased gradually during the anther development, while a peak of DNA methylation level occurred in A1 and A2 at the tetrad stage, corresponding to the abortion period of microspore. This result suggested that the level of DNA methylation in the tassels is associated with the pollen abortion characteristics in CMS lines. In summary, our results implied a connection between pollen abortion and epigenetic regulation in maize CMS.

maize; cytoplasmic male sterility; cytological observation; DNA methylation

2014-01-17;

2014-05-28

國家自然科學基金項目(編號：30971794)資助

張艷花，碩士研究生，專業(yè)方向：玉米細胞質雄性不育。E-mail: 1020452562@qq.com

易洪楊，碩士研究生，專業(yè)方向：玉米生物技術育種，E-mail: 1182550843@qq.com

張艷花和易洪楊同為第一作者。

曹墨菊，教授，研究方向：玉米雄性不育。E-mail: caomj@sicau.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.1021

時間: 2014-9-24 10:36:30

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140924.1036.004.html