張蕾, 隋御, 王婷, 李利堅, 李元杰, 金彩霞, 徐方

1. 寧夏醫(yī)科大學檢驗學院, 寧夏生殖與遺傳重點實驗室, 銀川 750004;

2. 同濟大學醫(yī)學院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心, 上海 200072

hMMS2基因?qū)Y(jié)腸癌細胞耐藥逆轉(zhuǎn)的影響

張蕾1, 隋御1, 王婷1, 李利堅1, 李元杰1, 金彩霞2, 徐方1

1. 寧夏醫(yī)科大學檢驗學院, 寧夏生殖與遺傳重點實驗室, 銀川 750004;

2. 同濟大學醫(yī)學院轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心, 上海 200072

為探討hMMS2(Human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2)基因?qū)θ私Y(jié)腸癌細胞耐藥逆轉(zhuǎn)的影響,文章以人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞(THC8307/L-OHP)為實驗材料, 采用脂質(zhì)體-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了帶有干擾目的基因hMMS2的miRNA片段并攜帶綠色熒光蛋白標記重組質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)的細胞系, 通過實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)和免疫熒光技術(shù)(Immunostaining technique)檢測該細胞系的干擾效率。選擇 hMMS2低表達具有統(tǒng)計學意義的上述細胞系作為實驗組細胞, 同時將未曾作過處理的 THC8307/ L-OHP細胞作為空白對照組, 轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白空質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR)的 THC8307/L-OHP細胞作為陰性對照組, 以噻唑藍比色分析實驗(MTT colorimetric analysis assay)、克隆形成實驗(Colony formation assay)對 3組細胞的存活率和克隆形成率進行檢測, 結(jié)果顯示：實驗組細胞的奧沙利鉑半數(shù)抑制濃度(Half inhibition concentration, IC50)、耐藥指數(shù)(Resistance index, RI)及克隆形成率(Colony-forming efficiency, CFE)均比對照組細胞明顯降低(P＜0.05), 而相對逆轉(zhuǎn)率(Relative reverse efficiency, RRE)增高(P＜0.05), 提示實驗組細胞增殖能力減弱; 以羅丹明123實驗(Rhodamine 123 assay)結(jié)合倒置熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測技術(shù)等觀測細胞的凋亡變化, 結(jié)果顯示, 實驗組細胞的凋亡率較對照組細胞顯著增高(P＜0.05); 兩對照(空白、陰性)組間并無細胞增殖或凋亡的顯著性差異。研究結(jié)果提示：下調(diào)hMMS2基因表達可逆轉(zhuǎn)人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞對L-OHP的耐藥性并促進結(jié)腸癌細胞的凋亡。

RNA干擾; 鉑類耐藥; hMMS2; 人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞(THC8307/L-OHP); 細胞凋亡

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一, 隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活方式的改變, 其患病率也逐年上升, 嚴重危害人類生命健康[1]?；熓墙Y(jié)腸癌綜合治療的重要手段, 其中奧沙利鉑(Oxaliplatin, L-OHP)是臨床上治療結(jié)腸癌最常用的化療藥物, 尤其對于中晚期結(jié)腸癌的治療及預(yù)防復發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要的意義。臨床上腫瘤的化療是一個多種藥物聯(lián)合使用的漫長過程, 隨著大劑量多種藥物的同時使用, 細胞的多藥耐藥(Multidrug resistance, MDR)問題也隨之產(chǎn)生, 并且成為結(jié)腸癌等惡性腫瘤細胞治療中“攻而未解”的難題[2]。隨著分子生物學技術(shù)手段的發(fā)展,以RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)調(diào)控目的基因表達來實現(xiàn)細胞的耐藥性逆轉(zhuǎn)成為腫瘤治療的一條新思路。本課題組曾對鉑類藥物耐藥分子機制密切相關(guān)的跨損傷DNA合成系統(tǒng)[3](Translesion DNA synthesis, TLS)進行了研究, 將該系統(tǒng)的易誤修復途徑(Error-prone repair, EPR)中的關(guān)鍵基因 REV3L (REV3-like, polymerase (DNA directed), zeta, catalytic subunit)作為靶基因, 研究其與逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥性關(guān)系[4], 為更深入地探討多藥耐藥性提供相應(yīng)的支持與保障。本文繼續(xù)這一思路, 對該系統(tǒng)的無誤修復途徑(Error-free repair, EFR)的關(guān)鍵基因 hMMS2 (Human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2)與逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌的耐藥性進行研究。hMMS2基因?qū)儆赗AD6上位群基因[5], 在細胞分化及腫瘤的發(fā)生中扮演著重要角色, 它編碼一種泛素綴合酶樣蛋白, 其氨基酸序列及二、三級結(jié)構(gòu)類似于泛素綴合酶(Ubiquitin-conjugating enzyme)[6]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明：通過抑制DNA聚合酶ζ或者跨損傷修復途徑, 可逆轉(zhuǎn)卵巢癌、肺癌等多種腫瘤耐藥細胞的耐藥性[7～10]。目前, 主要開展了 polη介導的無誤性修復途徑和polζ介導的易誤性修復途徑與鉑類耐藥性關(guān)系的研究。本研究通過下調(diào)人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞(THC8307/L-OHP)的hMMS2基因表達, 檢測其相應(yīng)的細胞增殖和凋亡變化情況, 以此來評價目的基因、鉑類藥物與細胞耐藥性形成和逆轉(zhuǎn)之間的關(guān)系, 為臨床腫瘤治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料

人高分化結(jié)腸癌細胞系(THC8307)及人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞系(THC8307/L-OHP)由天津醫(yī)科大學生命科學中心實驗室湯華教授建立并惠贈。

1.2 方法

1.2.1 hMMS2 miRNA的構(gòu)建

根據(jù)GenBank hMMS2基因(NM_003350)已知序列的基因信息, 設(shè)計 miRNA的靶序列: 5′-TGCTGTTACGAGGAACTTTAACTCCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGGAGTTAGTTCCTCGTAA-3′, 反義鏈為5′-CTGTTACGAGGAACTAACTCCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGGAGTTAAAGTTCCTCGTAAC-3′,將設(shè)計合成的 miRNA oligos復性連接至 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體, 構(gòu)建完成的hMMS2基因沉默載體經(jīng)轉(zhuǎn)化 DH5α感受態(tài)細胞后, 選取陽性克隆純化后送上海松正生物科技有限公司進行測序。

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

THC8307(親本系)常規(guī)培養(yǎng), THC8307/L-OHP (耐藥系)需加入 6 μg/mL的奧沙利鉑(南京制藥廠,產(chǎn)品批號：20100602)維持其耐藥性。實驗前1周耐藥細胞需撤去藥物常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞進行轉(zhuǎn)染, 按 LipofectamineTM2000試劑盒(Invitrogene公司)說明書進行操作。實驗分3組進行：①空白對照組：未經(jīng)任何處理的THC8307/L-OHP細胞; ②陰性對照組：為轉(zhuǎn)染陰性空質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR)的THC8307/L-OHP細胞; ③實驗組：為轉(zhuǎn)染實驗組質(zhì)粒(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2)的THC8307/L-OHP細胞。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測細胞hMMS2基因的表達量

將親代THC8307及3組耐藥THC8307/L-OHP細胞(空白對照組、陰性對照組、實驗組), 分別于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h 后在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況及細胞形態(tài)變化。再繼續(xù)培養(yǎng)24 h后, 1 000 r/min 離心收集上述3組耐藥細胞及親代細胞 THC8307, 按總 RNA提取試劑盒說明書提取RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA, 并利用實時熒光定量PCR檢測各組細胞目的基因的相對表達量。qRT-PCR擴增體系：10 μg/mL的樣品cDNA 5 μL, 2×Real-time PCR Master Mix 12.5 μL, 上、下游引物各 0.5 μL, 去離子水 6 μL, Passive Reference Dye (PRD) 0.5 μL, 總反應(yīng)體系 25 μL。根據(jù) NCBI中GenBank公布的 cDNA序列(NM_003350), 應(yīng)用軟件Primer 5設(shè)計擴增hMMS2基因的引物。上游引物：5′-CGGTCTCCACAGGAGTTAAAGT-3′; 下游引物：5′-TGTCCAGGTCATGTTTACCAGC-3′。為避免基因組DNA污染, 引物設(shè)計原則為上、下游引物跨兩個外顯子[11]。內(nèi)參基因GAPDH上游引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3′, 下游引物 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。qRT-PCR擴增條件為：95℃ 3 min; 93℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min。3次實驗所得數(shù)據(jù)通過比較CT值法( 2-ΔΔCT) 進行相對定量分析。

1.2.4 免疫熒光技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后 THC8307/L-OHP細胞 MMS2蛋白表達的變化

細胞轉(zhuǎn)染 48 h后, 各組細胞按 4 ×105/ mL、2 mL/孔接種于6孔板中; 4%多聚甲醛固定細胞10 min, PBS洗3遍, 每次5 min; 0.5%TritonX-100對細胞透化處理10 min, PBS洗3遍, 每次5 min; 10%山羊血清封閉30 min, PBS洗3遍; 滴加1∶200一抗(兔抗人MMS2單克隆抗體, 美國abcam公司), 4℃過夜, PBS洗3遍, 每次5 min; 滴加1:100二抗(FITC標記山羊抗兔 IgG, 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司), 37℃孵育 l h, PBS洗3遍, 每次5 min; 加入0.5 μg/mL DAPI (DAPI染色試劑盒, 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)染色10 min, PBS 洗3遍, 在避光條件下, l h內(nèi)倒置熒光顯微鏡下拍照并分析結(jié)果。

1.2.5 MTT 法(噻唑藍比色分析實驗)檢測轉(zhuǎn)染后THC8307/L-OHP細胞的增殖活性

取THC8307及轉(zhuǎn)染24 h后的THC8307/L-OHP各組細胞5×104/孔接種于96孔板中, 設(shè)5個藥物濃度梯度：0.06 μg/mL、0.6 μg/mL、6 μg/mL、60 μg/mL和600 μg/mL, 加入100 μL/孔。培養(yǎng)48 h后, 按MTT試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)說明書操作, 在酶聯(lián)免疫檢測儀上測OD490值, 取5個復孔的平均吸光度(OD)值, 每組重復 3次, 根據(jù)吸光度報告計算細胞存活率(%)=OD加藥組/ OD對照組×100%, 細胞生長抑制率(%)=1-細胞存活率=1-OD加藥組/ OD對照組× 100%, 運用改良寇氏法(改良Logit法)確定奧沙利鉑對各組細胞的半數(shù)抑制濃度(Half inhibition concentration, IC50), 進一步計算出耐藥指數(shù)(Resistance index, RI)=耐藥細胞 IC50/親本細胞 IC50和相對逆轉(zhuǎn)效率(Relative reverse efficiency, RRE)=(未轉(zhuǎn)染組IC50-轉(zhuǎn)染組 IC50)/(未轉(zhuǎn)染組 IC50-親本細胞 IC50) ×100%。

1.2.6 Rh123單染法檢測轉(zhuǎn)染后 THC8307/L-OHP細胞凋亡情況

取上述轉(zhuǎn)染24 h后的各組THC8307/L-OHP細胞按4×105個/孔接種與六孔板中, 培養(yǎng)24 h后收獲細胞懸液, 按羅丹明 123試劑盒(Rh123, 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)染色細胞, 在同一曝光率下,倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞的形態(tài)及其熒光強度,并以IPP 6.0軟件統(tǒng)計平均熒光強度。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測轉(zhuǎn)染后

THC8307/L-OHP細胞聯(lián)合L-OHP的凋亡率

取上述轉(zhuǎn)染24 h后的THC8307/L-OHP各組細胞, 調(diào)整濃度至4×105/mL, 以2 mL/孔接種于 6孔板, 培養(yǎng)24 h后加入終濃度為 60 μg/mL L-OHP, 置于 37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)16 h, 分別收集各處理組細胞, 按 Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)操作說明采用AV/PI雙染, 避光放置10 min, 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.8 平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力和細胞增殖情況

轉(zhuǎn)染24 h后, 將3組THC8307/L-OHP細胞按50、100、200、500、1000、2000的細胞密度分別接種于3個6孔板中, 向相應(yīng)每孔中分別加入0 μg/mL、0.06 μg/mL、0.6 μg/mL、6 μg/mL、60 μg/mL 和600 μg/mL濃度的奧沙利鉑, 常規(guī)培養(yǎng)10 d后, 甲醇固定15 min、姬姆薩染色30 min, 肉眼計數(shù)含有50個細胞以上、直徑＞ 0.5 mm 的克隆數(shù)量, 計算細胞克隆形成率?？寺⌒纬陕?%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

1.2.9 微核的測定檢測基因表達改變所致的遺傳不穩(wěn)定現(xiàn)象

細胞轉(zhuǎn)染48 h后取出各組細胞各一皿, PBS沖洗后, 姬姆薩染色, 鏡檢。在高倍鏡下, 選擇細胞均勻的視野, 隨機選取1000個完整的細胞, 計數(shù)所含微核的細胞數(shù)。微核的判斷標準：分布在主核邊、形態(tài)為圓形或橢圓形, 并且染色與主核相同但又獨立于主核的、大小約為主核的1/20～1/4的微小核。

1.3 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復 3 次, 所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 16.0 軟件分析, 以均數(shù)±標準差表示, 組間比較采用單因素方差分析(SNK 法), P＜0.05 為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 hMMS2基因沉默載體的測序結(jié)果

構(gòu)建完成的hMMS2基因沉默載體經(jīng)轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞后, 取陽性克隆純化后進行測序, 經(jīng)比較, 測序結(jié)果與設(shè)計序列相同, 表明 pre-miRNA 片段完整正確地插入到載體 pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR 中, 提示針對靶基因hMMS2的miRNA干擾質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 干擾效能鑒定

2.2.1 hMMS2基因在細胞中表達的變化

qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示：THC8307/L-OHP細胞中hMMS2的相對表達量是THC8307細胞的(3.24 ± 0.78), 顯著高于敏感株細胞中的表達量(P＜0.05,圖 1A) , THC8307/L-OHP細胞轉(zhuǎn)染含hMMS2-miRNA實驗組質(zhì)粒 24 h 后, 細胞中hMMS2基因的相對表達量是THC8307/L-OHP細胞的(0.302 ± 0.136) (P＜0.05); 轉(zhuǎn)染陰性空質(zhì)粒細胞的相對表達量是THC8307/L-OHP細胞的(0.923±0.256) (P＞0.05, 圖1B)。結(jié)果表明：小RNA干擾片段成功抑制實驗組細胞hMMS2基因的表達, 而空質(zhì)粒對hMMS2基因表達無大影響。

圖1 qRT-PCR檢測hMMS2基因在細胞中的表達A: qRT-PCR檢測hMMS2 在THC8307 和THC8307/L-OHP細胞中的表達(將THC8307表達量設(shè)為100%); B: qRT-PCR檢測hMMS2 在轉(zhuǎn)染THC8307/L-OHP 細胞后的表達。K：空白組; Y：陰性組; S：實驗組; 將空白組表達量設(shè)為100%; *表示P＜0.05。

2.2.2 MMS2蛋白在細胞內(nèi)表達水平的測定

IPP 6.0軟件分析各組細胞平均熒光強度顯示(表 1), 實驗組與對照組相比, MMS2蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。在蛋白水平上證明基因下調(diào)成功(圖2)。

表1 各組細胞的平均熒光強度

圖2 倒置熒光顯微鏡觀察MMS2蛋白在細胞中的表達(400倍)

2.3 下調(diào)hMMS2基因后THC8307/L-OHP細胞對L-OHP敏感性的變化

MTT法檢測發(fā)現(xiàn)(表 2), 實驗組與兩對照組比較, RI值明顯降低, 而相對逆轉(zhuǎn)率明顯增高(P＜0.05)。從圖 3可以看出, 經(jīng)48 h連續(xù)給藥(L-OHP)處理后,均可抑制各組細胞生長增殖并呈濃度依賴性。在同一藥物濃度下, 實驗組細胞抑制率較兩對照組顯著升高, 說明下調(diào) hMMS2基因可以抑制 THC8307/ L-OHP細胞的生長, 提高 THC8307/L-OHP細胞對化療的敏感性。

圖3 不同劑量的L-OHP對各組細胞的殺傷作用

表2 各組細胞對L-OHP的敏感性

2.4 下調(diào)hMMS2基因?qū)毎蛲龅挠绊?/p>

2.4.1 Rh123熒光染色

同一視野和曝光率下, 各組細胞熒光照片, 兩對照組細胞形態(tài)完整, 染色均勻; 實驗組多為凋亡細胞, 形態(tài)出現(xiàn)殘缺, 染色不均勻(圖4)。IPP 6.0分析平均熒光強度顯示(表3)：基因下調(diào)組平均熒光強度強于空白組和陰性對照組(P＜0.05), 空白組和陰性對照組無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。結(jié)果表明：hMMS2基因下調(diào)后促進結(jié)腸癌細胞凋亡。

2.4.2 流式細胞術(shù)分析 Annexin V-FITC/PI熒光染色結(jié)果

圖4 倒置熒光顯微鏡觀察下調(diào)hMMS2基因后Rh123熒光染色細胞形態(tài)(400倍)

表3 各組細胞的平均熒光強度

經(jīng)L-OHP處理16 h后, 流式細胞術(shù)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組與兩對照組相比凋亡率增高, 差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 空白組和陰性對照組之間無顯著性差異(P＞0.05) (圖5, 表4)。結(jié)果表明, 沉默hMMS2 基因可通過誘導凋亡增強 THC8307/L-OHP細胞對L-OHP的敏感性。

2.5 基因下調(diào)對細胞克隆形成能力和增殖能力的影響

由表5可見, 3組細胞在L-OHP ＞0.6 μg/mL時,隨藥物濃度增加, 克隆形成率均明顯降低, 且轉(zhuǎn)染組較兩對照組細胞克隆形成率明顯降低(P＜0.05),但600 μg/mL時的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05), 提示下調(diào) hMMS2基因增加 THC8307/L-OHP細胞對L-OHP的敏感性。

2.6 基因下調(diào)對細胞微核產(chǎn)生的影響

實驗組細胞微核數(shù)值如表6所示：較兩對照組細胞的微核數(shù)值明顯降低, 差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05), 而兩對照組細胞之間微核數(shù)值沒有統(tǒng)計學差異。提示hMMS2基因可能與微核的產(chǎn)生有關(guān)系。

3 討 論

圖5 流式細胞術(shù)檢測下調(diào)hMMS2基因?qū)o予L-OHP處理的THC8307/L-OHP細胞凋亡的影響

表4 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率(%,±s)

表4 流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率(%,±s)

注：實驗組與兩對照組比較, *P＜0.05; 兩對照組比較, P＞0.05。

組別 早期細胞凋亡 晚期細胞凋亡THC8307/L-OHPblank11.48±0.423.92±0.26THC8307/L-OHPcontrol12.93±0.634.27±0.17THC8307/L-OHPhMMS2↓19.76±0.78*6.06±0.34*

化療是結(jié)腸癌治療的重要手段之一, 然而長時間多種藥物的聯(lián)合使用會產(chǎn)生多藥耐藥現(xiàn)象, 導致療效的降低甚至化療的失敗, 鉑類耐藥現(xiàn)象是結(jié)腸癌治療中較為常見的現(xiàn)象, 因此研究鉑類耐藥是解決結(jié)腸癌耐藥的路徑之一, 國內(nèi)外大量的研究已證實跨損傷 DNA合成途徑與逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對鉑類藥物敏感性存在一定的因果關(guān)系, 明確了跨損傷DNA合成途徑在修復鉑類藥物引起的 DNA交連損傷中起關(guān)鍵作用[12,13], 可以通過抑制跨損傷 DNA 合成途徑來提高鉑類化療敏感性[14]。Albertella等[7]發(fā)現(xiàn)polη可以通過跨損傷合成途徑幫助腫瘤細胞跨越順鉑引起的損傷, 缺失 polη細胞對順鉑的敏感性顯著增加。Doles等[8]通過構(gòu)建耐藥性非小細胞肺腺癌小鼠模型, 運用RNA干擾技術(shù)靶向降低mREV3的表達, 腫瘤細胞表現(xiàn)出對順鉑作用的顯著增敏。這與Lin等[9]用同樣方法進行體外實驗的結(jié)果一致。同時Okuda等[10]發(fā)現(xiàn)易誤性修復途徑的 REV1L 基因也在修復鉑類引起的 DNA 損傷中扮演重要作用, 抑制其表達后, 耐藥性卵巢癌細胞對順鉑的敏感性增加 1.5倍。這些研究結(jié)果均表明, 可通過抑制跨損傷DNA合成途徑的相關(guān)基因表達來逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥。盡管對于 hMMS2與鉑類耐藥性逆轉(zhuǎn)的研究目前開展尚少, 然而 hMMS2與增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA)泛素化過程密切相關(guān)已是相關(guān)實驗證明了的事實, PCNA泛素化過程可調(diào)控聚合酶的轉(zhuǎn)換, 從而啟動跨損傷復制過程[15～17],因此提示 hMMS2與鉑類耐藥性逆轉(zhuǎn)可能存在一定的相關(guān)性。

表5 不同濃度L-OHP作用后細胞克隆形成率(±s)

表5 不同濃度L-OHP作用后細胞克隆形成率(±s)

注：與0 μg/mL組比較, *P＜0.05 ; 實驗組與兩對照組比較,△P＜0.05; 兩對照組比較, P＞0.05。

組別藥物濃度(μg/mL) 0 0.06 0.6 6 60 600THC8307/L-OHPblank1.0000.754±0.064*0.746±0.039*0.668±0.066*0.416±0.041*0.021±0.002*THC8307/L-OHPcontrol1.0000.734±0.071*0.706±0.030*0.610±0.029*0.388±0.049*0.024±0.004*THC8307/L-OHPhMMS2↓1.0000.609±0.020*△0.545±0.019*△0.486±0.021*△0.321±0.034*△0.019±0.005*

表6 hMMS2表達量的不同對細胞微核產(chǎn)生的影響

本研究通過 qRT-PCR、MTT、平板克隆形成等實驗研究和分析, 發(fā)現(xiàn) hMMS2可能參與了結(jié)腸癌細胞的多藥耐藥形成, 下調(diào) hMMS2基因可以增加THC8307/L-OHP細胞對 L-OHP的敏感度。同時還發(fā)現(xiàn)hMMS2體外轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌THC8307/L-OHP細胞后, hMMS2低表達可抑制結(jié)腸癌細胞的生長, 促進化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用, 提高化療的敏感性, 并對化療藥物有劑量依賴性。進一步研究發(fā)現(xiàn), 在相同劑量L-OHP作用下, 下調(diào)hMMS2 基因表達可以促進結(jié)腸癌耐藥細胞的自發(fā)凋亡, 提示由TLS介導的腫瘤細胞耐藥過程中可能有凋亡機制的參與, 這與Philip等[18]發(fā)現(xiàn)TLS可使P53凋亡信號通路中的調(diào)控分子表達和功能失常引起腫瘤細胞凋亡的報道是一致的。上述實驗結(jié)果表明下調(diào)hMMS2基因的表達對逆轉(zhuǎn)人高分化耐奧沙利鉑結(jié)腸癌細胞(THC8307/L-OHP)的耐藥性有一定影響, 在一定程度上恢復了耐藥細胞對化療藥物的敏感性, 或許這是通過抑制 PCNA 的泛素化作用來實現(xiàn)的, 因為hMMS2可與UBC13-RAD5結(jié)合形成Rad8Rad5/Mms2-Ubc13復合物對PCNA進行泛素化修飾[16], 而PCNA泛素化修飾主要介導了細胞 DNA 在 S 期的損傷應(yīng)答作用, 從而降低鉑類藥物所引起的細胞凋亡,引起鉑類耐藥性的產(chǎn)生[19]。同時PCNA 泛素化修飾可誘發(fā)基因組DNA交連的產(chǎn)生及DNA 高突變[15],這也是鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵, 以及在使用過程中加劇機體毒副作用的機制之一[20]。由此可見,下調(diào)hMMS2基因一方面可促進結(jié)腸癌細胞凋亡, 另一方面又可作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑, 增加了結(jié)腸癌細胞對鉑類藥物敏感性, 使得化療藥物對腫瘤的殺傷作用增強, 由此可減少化療藥物的劑量, 從而減輕其對機體的毒副作用, 為臨床治療腫瘤提供一種新思路。

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(責任編委: 盧大儒)

Roles of hMMS2 gene in reversing the oxaliplatin tolerance of human colon carcinoma cells

Lei Zhang1, Yu Sui1, Ting Wang1, Lijian Li1, Yuanjie Li1, Caixia Jin2, Fang Xu1

1. Ningxia Key Laboratory of Reproduction and Genetics, College of Inspection, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China;
2. Center for Translational Medicine, School of Medicine, Tongji University, Shanghai 200072, China

In this study, the roles of hMMS2 (human methyl methanesulfonate sensitive mutant 2) gene encoding the hu-man ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2 in the drug resistance in human colon carcinoma were investigated by using a well-differentiated human colorectal carcinoma L-OHP-resistant cell line, THC8307/L-OHP. THC8307/L-OHP cells were transfected via liposome along with plasmid pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-MMS2 expressing both miRNA against hMMS2 and GFP, followed by real-time fluorescent quantitative PCR and immunofluorescence to select stable transfectants with significantly reduced hMMS2 expression. Compared with untransfected or pcDNA6.2-GW/EmGFP vector-transfected cells, the hMMS2-depleted cells displayed significantly (P＜0.05) reduced half inhibition concentration(IC50) resistance index (RI) and colony-forming efficiency (CFE) upon treatment with oxaliplatin (L-OHP), while its relative reverse efficiency(RRE) was significantly higher (P＜0.05) than the control cells, indicating compromised ability of cell proliferation. Indeed, Rhodamine 123 staining and flow cytometry analyses revealed an increased rate of apoptosis in hMMS2-depleted cells while no difference in cell proliferation or apoptosis was observed between the two control cell lines. The above observations collectively indicate that suppression of hMMS2 reverses L-OHP tolerance in differentiated human colorectal carcinoma cells by promoting apoptosis.

RNA interference; platinum resistance; hMMS2; human well-differentiated colorectal carcinoma L-OHP-resistant cell line; apoptosis

2013-10-12;

2014-01-29

國家自然科學基金項目(編號：81060170, 31360251); 教育部“春暉計劃”項目(編號：Z2011056); 銀川市應(yīng)用研究開發(fā)計劃項目(編號：銀財發(fā)(2012)249)資助

張蕾, 在讀碩士研究生, 專業(yè)方向：DNA損傷與修復。E-mail: 2427084464@qq.com

徐方, 教授, 博士生導師, 研究方向：DNA損傷與修復。E-mail: xufang@nxmu.edu.cn

10.3724/SP.J.1005.2014.0346

時間: 2014-3-27 14:33:05

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140327.1433.002.html