葉斯斯，蔣張亮，煉石金，陳 勇，趙肖為，周茂洪

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035)

葉斯斯，蔣張亮，煉石金，陳 勇，趙肖為，周茂洪?

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325035)

以采自溫州西片污水處理廠曝氣池的活性污泥樣品中分離獲得的好氧反硝化施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）WZUF25研究對(duì)象，分析其在最適宜條件下在人工污水中菌體生長(zhǎng)和去除進(jìn)程及反硝化占總氮去除率；采用海藻酸鈣-活性炭包埋法固定Pseudomonas stutzeri WZUF25，研究固定化細(xì)胞在最適宜條件下去除進(jìn)程和完整性．研究得出：Pseudomonas stutzeri WZUF25的脫能力明顯比目前報(bào)道的好氧反硝化菌強(qiáng)，其海藻酸鈣-活性炭固定化細(xì)胞去除人工污水的過(guò)程中，固定化膠珠是完整的．

施氏假單胞菌；固定化；海藻酸鈣-活性炭；好氧反硝化

氨氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮在內(nèi)的“三氮”以及重金屬是目前地下水的普遍污染物，水體的氮污染不僅可引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，還可直接影響動(dòng)物及人體的健康．脫氮是污水處理過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)理論認(rèn)為生物脫氮必須經(jīng)過(guò)好氧硝化和缺氧反硝化兩個(gè)過(guò)程，因此傳統(tǒng)脫氮技術(shù)在實(shí)際操作中受到許多限制．近30年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大量的研究報(bào)道證明好氧反硝化菌的存在，且發(fā)現(xiàn)大多數(shù)好氧反硝化菌表現(xiàn)異養(yǎng)硝化的特性[1]．異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的發(fā)現(xiàn)為生物脫氮提供了全新的途徑，使同步硝化/反硝化成為可能．因此，研究有著良好的生物相容性和較高生物脫氮效率的好氧反硝化細(xì)菌并運(yùn)用于實(shí)踐，對(duì)生物脫氮工程有著重大意義．

20世紀(jì)80年代，Robertson和Kuenen[2]在除硫和反硝化處理系統(tǒng)中，首次分離出好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha（現(xiàn)更名為脫氮副球菌Paracoccus denitrifications[3]）．此后，國(guó)內(nèi)外研究者不斷有從不同生態(tài)環(huán)境中分離獲得好氧反硝化菌并研究其好氧反硝化特性的報(bào)道[4-11]．目前發(fā)現(xiàn)好氧反硝化現(xiàn)象僅在細(xì)菌中存在，主要存在于假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）等土壤、水體常見(jiàn)種屬中[12]．圍繞Thiosphaera pantotropha開(kāi)展的關(guān)于好氧反硝化的酶系也被較深入地研究[13]．圍繞好氧反硝化菌在廢水生物處理、養(yǎng)殖廢水處理和降解有機(jī)物等方面的應(yīng)用也有報(bào)道[14-16]，但總的來(lái)說(shuō)主要停留于實(shí)驗(yàn)室研究，未真正應(yīng)用于實(shí)踐．

傳統(tǒng)的污水生物處理工藝以微生物懸浮態(tài)生長(zhǎng)的活性污泥處理法為主．固定化細(xì)胞技術(shù)用于廢水生物處理與傳統(tǒng)的懸浮生物處理法比較具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)在廢水生物處理尤其是在特種水處理領(lǐng)域進(jìn)行了廣泛的研究．近年來(lái)，固定化硝化菌脫氮技術(shù)已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模試驗(yàn)階段進(jìn)入大規(guī)模的生產(chǎn)性試驗(yàn)階段，已有許多公開(kāi)專利[17-18]，而固定化好氧反硝化菌脫氮技術(shù)還處于實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模試驗(yàn)階段．

本文報(bào)道了采用海藻酸鈣-活性炭包埋法固定采自溫州西片污水處理廠曝氣池的活性污泥中分離獲得的施氏假單胞菌，并對(duì)固定化細(xì)胞脫進(jìn)行了研究．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）WZUF25，由溫州大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室自溫州西片污水處理廠曝氣池的活性污泥中分離獲得．

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母膏5，蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂18，pH 7.0．

1.2 方 法

1.2.1 游離細(xì)胞生長(zhǎng)和去除NO3--N進(jìn)程測(cè)定

將保藏菌株（2.0 ml冷凍管融化的菌液）接種于裝有200 ml LB液體培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中，在30℃、160 rpm下培養(yǎng)24 h，在5 000 rpm下離心10 min得菌體，并用無(wú)菌蒸餾水洗滌菌體2次，用無(wú)菌水制成菌懸液（OD6800.900 – 1.000）．然后按5%體積比的接種量轉(zhuǎn)接于裝有200 ml人工污水的500 ml錐形瓶中，在適宜條件下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定OD680，然后在8 000 rpm下離心10 min后測(cè)定上清液和濃度，計(jì)算去除率和積累量．去除率/%=（起始濃度－結(jié)束濃度）/起始濃度×100，起始濃度和結(jié)束濃度均為三個(gè)平行樣的平均值．

采用酚二磺酸法分光光度法[19]．

1.2.3 游離細(xì)胞反硝化占總氮去除率測(cè)定

將保藏菌株（2.0 ml冷凍管融化的菌液）接種于裝有200 ml LB液體培養(yǎng)基的500 ml錐形瓶中，在30℃、160 rpm下培養(yǎng)24 h，在5 000 rpm下離心10 min得菌體，并用無(wú)菌蒸餾水洗滌菌體2次，用無(wú)菌水制成菌懸液（OD6800.900 – 1.000），然后按5%體積比的接種量接入裝有200 ml人工污水的500 ml錐形瓶中．將接種后的培養(yǎng)基在8 000 rpm下離心10 min，測(cè)定上清液的濃度，計(jì)算總氮量；沉淀用凱氏定氮法測(cè)定菌體總氮量；兩者之和表示起始總氮量．另將接種后的培養(yǎng)基在30℃、150 rpm – 160 rpm下培養(yǎng)24 h，在8 000 rpm下離心10 min后得上清液和菌體；測(cè)定上清液的和濃度和體積，計(jì)算培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基總氮量；沉淀用凱氏定氮法測(cè)定菌體總氮量；兩者之和表示培養(yǎng)結(jié)束后總氮量．反硝化占總氮去除率/%=（起始總氮量－結(jié)束總氮量）/起始總氮量×100，起始總氮量和結(jié)束總氮量均為三個(gè)平行樣的平均值．

1.2.4 海藻酸鈣-活性炭固定化細(xì)胞制備及固定化細(xì)胞去除試驗(yàn)

2 結(jié)果與討論

2.1 游離細(xì)胞生長(zhǎng)與去除NO3--N進(jìn)程

在以往的報(bào)道①專利, 申請(qǐng)?zhí)? 201310375037.8, 本團(tuán)隊(duì)前期研究成果, 專利在申請(qǐng)階段, 尚未公開(kāi).，已研究清楚施氏假單胞菌WZUF 25的耐受度為2 g·L-1KNO3、最適宜碳源為丁二酸鈉、丁二酸鈉和KNO3的適宜重量比為10∶2、適宜溫度為20℃ – 40℃、適宜pH 為5 – 9、適宜搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm – 200 rpm．按方法1.2.1將菌液接入人工污水后在30℃、160 rpm下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定生物量（OD680）、和濃度，計(jì)算去除率，結(jié)果見(jiàn)圖1．

圖1 施氏假單胞菌WZUF 25在人工污水中生長(zhǎng)和去除進(jìn)程

近30年來(lái)，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道從不同生態(tài)環(huán)境中篩選到好氧反硝化菌，它們的生理生態(tài)性能和脫氮能力均不相同．如楊小龍等[11]從魚塘水樣中分離到1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.），以KNO3為唯一氮源的培養(yǎng)液中，可在24 h內(nèi)將培養(yǎng)液中從161.61 mg·L-1降至55.69 mg·L-1，去除速率為4.41 mg·L-1h-1．又如朱月琪等[21]從土壤中分離得到一株好氧反硝化細(xì)菌泛養(yǎng)副球菌（Paracoccus pantotrophus），該菌株在厭氧和好氧條件下均具有反硝化能力，硝酸鹽氮初始濃度為137.25 mg/L，30 h內(nèi)硝酸鹽氮去除率分別為99.98%（厭氧）和60.16%（好氧）．Jibin Zhang等[22]從豬糞污水中分離獲得1株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri YZN-001），在30℃下去除的速率為10.99 mg·L-1h-1．本文報(bào)道的分離自溫州西片污水處理廠活性污泥的施氏假單胞菌WZUF 25在最適條件下，其去除的速率為16.31 mg·L-1h-1，顯然其脫能力明顯比目前報(bào)道的好氧反硝化菌強(qiáng)．

2.2 游離細(xì)胞反硝化占總氮去除率

按方法1.2.2進(jìn)行反硝化占總氮去除率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1．菌株WZUF25在適宜條件下，反硝化占總氮去除率為52.576±1.719%．由此可知反硝化過(guò)程中，接近一半氮源被菌體利用來(lái)生長(zhǎng)．

表1 反硝化占總氮去除率

按方法1.2.3制備海藻酸鈣-活性炭固定化細(xì)胞膠珠，膠珠細(xì)胞密度約2.5×109個(gè)/膠珠 – 3.0 ×109個(gè)/膠珠，并分別以50粒膠珠/100 ml和100粒膠珠/100 ml接入人工污水后在30℃、160 rpm下培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定和濃度，計(jì)算去除率，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3．

圖2 固定化細(xì)胞去除人工污水中的進(jìn)程(50粒皎珠/100 ml)

圖3 固定化細(xì)胞去除人工污水中的進(jìn)程(100粒膠珠/100 ml)

由圖2可以看出，接入50粒膠囊/100 ml培養(yǎng)24 h后去除率趨于穩(wěn)定；濃度由起始的0.208 mg·ml-1降至0.014 mg·ml-1，去除率為93.27%，去除速率為8.08 mg·L-1h-1．在12 h時(shí)積累達(dá)到最大，至24 h 時(shí)已降至1 μg·ml-1以下．

由圖3可以看出，接入100粒膠囊/100 ml培養(yǎng)12 h后去除率趨于穩(wěn)定；濃度由起始的0.208 mg·ml-1降至0.013 mg·ml-1，去除率為93.75%，去除速率為16.25 mg·L-1h-1．在9 h時(shí)積累達(dá)到最大，至16 h時(shí)已降至1 μg·ml-1以下．固定化細(xì)胞去除人工污水的過(guò)程中，固定化膠珠是完整的．

包埋固定化是目前使用最為普遍、最為有效的一種細(xì)胞固定化方法，海藻酸鈣凝膠包埋法具有凝膠珠粒制備方便、細(xì)胞固定量較高、對(duì)微生物毒性小等優(yōu)點(diǎn)，但其具有凝膠機(jī)械強(qiáng)度不夠的缺陷；為克服此不足，可在凝膠中加瓷圈、硅砂、面布、多空載體等支持物，以增加凝膠強(qiáng)度和沉降性[20]．本文采用的海藻酸鈣-活性炭包埋法制備的假單胞菌固定化細(xì)胞，在文中給出的條件下的試驗(yàn)表明是穩(wěn)定的，即培養(yǎng)結(jié)束后，固定化膠珠是完整的，但在實(shí)際應(yīng)用中的穩(wěn)定性（包括膠珠的完整性、重復(fù)使用性等）尚有待繼續(xù)研究．

3 結(jié) 論

研究了好氧反硝化的Pseudomonas stutzeri WZUF25在最適宜條件下，在人工污水中菌體生長(zhǎng)和去除進(jìn)程及反硝化占總氮去除率，以及海藻酸鈣-活性炭包埋法固定化的可行性，獲得如下結(jié)果：

（1）在適宜條件下，Pseudomonas stutzeri WZUF 25在人工污水中培養(yǎng)12小時(shí)后去除率達(dá)到95.50%，去除速率為16.31 mg·L-1h-1，且去除與生長(zhǎng)是同步的，積累小于1 μg·ml-1；

（2）反硝化占總氮去除率為52.576±1.719%；

（3）在50粒膠珠/100 ml接種量下，海藻酸鈣-活性炭固定化細(xì)胞在人工污水中培養(yǎng)24 h后去除率為93.27%，去除速率為8.08 mg·L-1h-1，積累小于1 μg·ml-1；在100粒膠珠/100 ml接種量下，海藻酸鈣-活性炭固定化細(xì)胞在人工污水中培養(yǎng)12 h后去除率為93.75%，去除速率為16.25 mg·L-1h-1，積累小于1 μg·ml-1；

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Research on Biological Removal ofwith Aerobic enitrifying Pseudomonas Stutzeri Immobilized in Calcium Alginate and Activated Carbon

YE Sisi, JIANG Zhangliang, LIAN Shijin, CHEN Yong, ZHAO Xiaowei, ZHOU Maohong
(College of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

This paper takes the aerobic denitrifying Pseudomonas stutzeri WZUF25, which was isolated fromactivated sludge collected samples of Wenzhou West Sewage Treatment Plant as the object of study. The study analizes the thallus growth, the course ofremoval and denitrification’s contribution to total nitrogen removal in the artificialwastewater, when it is in the most suitable conditions; and then using calcium alginate and activated carbon embedding immobilize Pseudomonas stutzeri WZUF25, to study the immobilized cells for removing theprocess and integrity in such conditions. The results show that: The ability of Pseudomonas stutzeri WZUF25 removing theproves significantly better than the current reported and the immobilized cells are complete in the process of removingin the artificialwastewater.

Pseudomonas stutzeri; Immobilization; Calcium Alginate and Activated Carbon; Aerobic Denitrification

X703

A

1674-3563(2014)04-0055-07

10.3875/j.issn.1674-3563.2014.04.009 本文的PDF文件可以從xuebao.wzu.edu.cn獲得

(編輯：封毅)

2014-03-26

溫州大學(xué)2013年學(xué)生科研立項(xiàng)(226)；溫州大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(JWDC2012044)

葉斯斯(1991- )，女，浙江永嘉人，研究方向：環(huán)境微生物學(xué)．? 通訊作者，zhoumh@wzu.edu.cn