趙 斐，謝 萍，姜佳麗，張令強，安 威，展玉濤

·酒精性肝病·

他莫昔芬體外促進HepG2細胞脂肪變性觀察*

趙 斐，謝 萍，姜佳麗，張令強，安 威，展玉濤

目的研究他莫昔芬（TAM）對體外培養(yǎng)的HepG2細胞脂肪變性以及脂類代謝調(diào)控關(guān)鍵因子表達的影響。方法應(yīng)用油酸（50 μmol/L）處理HepG2細胞，誘導(dǎo)細胞脂肪變性體外模型，同時給予不同濃度的TAM（5～20 μmol/L）干預(yù)72 h；采用油紅O染色和甘油三酯含量測定檢測HepG2細胞內(nèi)脂質(zhì)聚集情況；應(yīng)用蛋白印跡法檢測固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）、肉酯軟脂?；D(zhuǎn)移酶（CPT1）和微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（MTP）的表達；采用細胞活性檢測試劑盒測定細胞活性。結(jié)果在干預(yù)72 h后，模型組細胞內(nèi)甘油三酯含量為（16.53±0.17）mg/100 mg蛋白質(zhì)，在5 μmol/L TAM處理細胞內(nèi)甘油三酯含量為（17.77±0.05）mg/100mg蛋白質(zhì)，與模型組無顯著性差異，但在10 μmol/L和20 μmol/L TAM處理組較模型組分別增加了31%[（21.57±0.16）mg/100 mg蛋白質(zhì)]和44%[（23.82±0.44）mg/100 mg蛋白質(zhì)]，（P＜0.05）；TAM上調(diào)細胞內(nèi)SREBP-1c、FAS、SCD和MTP蛋白表達，但并不改變CPT1蛋白表達；TAM在5～20 μmol/L范圍內(nèi)不影響HepG2細胞活性。結(jié)論TAM可促進油酸誘導(dǎo)的HepG2細胞脂肪變性，其主要機制可能是通過上調(diào)SREBP-1c及其下游基因，如FAS和SCD的表達而增加了脂肪酸的合成。

HepG2細胞；他莫昔芬；脂肪變；甘油三酯；脂肪酸合成

乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤[1]，主要分為雌激素受體陽性（約占75%）和雌激素受體陰性乳腺癌兩種類型[2]。他莫昔芬（tamoxifen，TAM）是治療雌激素受體陽性乳腺癌的“金標準”藥物[3]，在臨床上應(yīng)用十分廣泛。然而，長期使用TAM會產(chǎn)生一系列的副作用，其中引起非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）最常見[4]。有資料顯示，TAM治療的女性乳腺癌患者有43%在治療的前2年內(nèi)出現(xiàn)脂肪肝或脂肪性肝炎，尤其是一些超重的女性，甚至?xí)霈F(xiàn)肝硬化[5]。因此，明確TAM促進NAFLD發(fā)生的機制，對于防治TAM引起的NAFLD具有重要意義。目前，一些針對TAM引起NAFLD機制的研究主要是在動物實驗，而且結(jié)果不一。在本研究中，我們運用體外肝細胞脂肪變性模型直接探索了TAM對HepG2細胞脂肪變性的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人肝癌細胞株HepG2細胞（北京地壇醫(yī)院傳染病學(xué)研究所惠贈）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（Hyclone公司）；0.25%胰酶（Gibco公司）；TAM、油紅O和二甲基亞砜（Sigma公司）；甘油三酯檢測試劑盒和蛋白定量檢測試劑盒（Bioassay公司）；細胞活性檢測試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所）；抗固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c）抗體、抗硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）抗體、抗肉酯軟脂?；D(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）抗體和抗微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白（microsomal triglyceride transfer protein，MTP）抗體（Abcam公司）；抗脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）抗體和相關(guān)二抗（Santa Cruz公司）；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（MBL公司）。

1.2 細胞脂肪變性模型的建立和TAM干預(yù)實驗取HepG2細胞，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中。選擇終濃度為50μM的油酸（oleic acid，OA）培養(yǎng)72 h，以誘導(dǎo)細胞脂肪變性。設(shè)模型組和TAM干預(yù)組。根據(jù)實驗的需要，將細胞鋪于不同規(guī)格的細胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，在接種細胞24 h后，將正常完全培養(yǎng)基更換為高脂培養(yǎng)基（OA=50 μM），同時分別加入終濃度為0、5、10和20 μmol/L的TAM，培養(yǎng)72 h，收集細胞。

1.3 細胞內(nèi)脂滴形成的觀察將細胞接種于6孔板內(nèi)，同時放入小蓋玻片，制作細胞爬片，按上述方法分組處理細胞72 h后，采用油紅O染色，觀察細胞內(nèi)的脂滴形成情況。以PBS沖洗細胞3次，10%中性甲醛固定5 min，加油紅O染液浸染15 min，60%異丙醇洗去多余染液，蘇木素染核1min，蒸餾水洗去多余的染色液，甘油明膠封片。在顯微鏡下觀察細胞內(nèi)的脂滴情況，攝像。

1.4 細胞內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分數(shù)測定將細胞培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，按上述方法分組處理72h，收集細胞，用胰酶消化后離心，取細胞沉淀，PBS洗滌2～3次，加入等滲緩沖液400μL，超聲破碎細胞，取破碎好的勻漿液進行測定。取10μL標準品和樣品，分別放入96孔板，每組設(shè)3個平行孔，在各孔中加入100μL配制好的工作試劑，室溫孵育30 min，于570 nm讀取吸光度。根據(jù)標準曲線，計算每組甘油三酯質(zhì)量分數(shù)，同時用蛋白質(zhì)定量試劑盒測定各組細胞樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)，對結(jié)果進行標準化（mg/100mg蛋白質(zhì)）。

1.5 脂類代謝關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子蛋白表達的檢測采用免疫印跡法，收集細胞，加入適量的細胞裂解液及等量的2×Sample buffer混和，100℃沸水煮10 min，進行SDS-PAGE電泳。切下含目的條帶的SDS變性膠，將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，進行電轉(zhuǎn)移，隨后在含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液中封閉60 min。封閉后，加一抗孵育，4℃過夜，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min。然后加耦聯(lián)HRP的二抗，室溫孵育1 h，最后經(jīng)TBST洗膜3次，加入底物化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室中進行X光片曝光顯影。

1.6 細胞活性檢測以CCK-8法檢測細胞活性，即將密度為1×105/mL細胞以100μL/孔接種于96孔板，每組設(shè)6個平行孔，按上述方法分組處理72 h，更換培養(yǎng)基為包含10μL CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，在450 nm讀取吸光度。數(shù)據(jù)以A450（他莫昔芬干預(yù)組+模型組）-A450（空白）表示。

2 結(jié)果

2.1 TAM促進OA誘導(dǎo)的細胞內(nèi)脂肪形成在光學(xué)顯微鏡下觀察，可見HepG2細胞為不規(guī)則或卵圓形，胞漿內(nèi)可見散在的紅色脂滴，經(jīng)不同濃度的TAM（0、5、10和20μmol/L）干預(yù)后，可見胞漿內(nèi)紅色脂滴數(shù)目增加，并且隨藥物濃度的增加呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（圖1～4）。

圖1 模型組HepG2細胞內(nèi)脂滴形成（油紅O染色，400×）

圖2 5μM TAM干預(yù)72 h后HepG2細胞內(nèi)脂滴形成（油紅O染色，400×）

圖3 10μM TAM干預(yù)72 h后HepG2細胞內(nèi)脂滴形成（油紅O染色，400×）

圖4 20μM TAM干預(yù)72 h后HepG2細胞內(nèi)脂滴形成（油紅O染色，400×）

2.2 TAM增加細胞內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分數(shù)在5μM TAM干預(yù)72 h后，HepG2細胞內(nèi)甘油三酯質(zhì)量分數(shù)（17.77±0.05）mg/100mg蛋白質(zhì)較模型組（16.53±0.17）mg/100mg蛋白質(zhì)略有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在10μM～20μM TAM干預(yù)72 h后，甘油三酯質(zhì)量分數(shù)較模型組分別增加了31%和44%[分別為（21.57±0.16）mg/100 mg蛋白質(zhì)和（23.82±0.44）mg/ 100 mg蛋白質(zhì)]，與模型組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 TAM對甘油三酯代謝相關(guān)分子蛋白表達的調(diào)節(jié)作用SREBP-1c是調(diào)控肝臟脂肪酸合成的重要轉(zhuǎn)錄因子，可促進一系列脂類合成相關(guān)基因的表達，包括FAS和SCD等。蛋白印跡檢測結(jié)果顯示（圖5），TAM干預(yù)上調(diào)了SREBP-1c的表達，并且作用呈劑量依賴性。與此相一致的是，F(xiàn)AS和SCD蛋白表達增加也呈現(xiàn)相似的效應(yīng)。同時，CPT1表達無明顯變化，而MTP表達上調(diào)。

圖5 不同濃度TAM干預(yù)后HepG2細胞SREBP-1c、FAS、SCD、CPT1和MTP蛋白表達

2.4 TAM對HepG2細胞活性的影響經(jīng)5～20μM TAM干預(yù)后HepG2細胞活性與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明我們所使用濃度范圍內(nèi)的TAM干預(yù)對HepG2細胞的數(shù)量無明顯影響，排除了各組甘油三酯質(zhì)量分數(shù)的差異是由細胞數(shù)量不同所致的可能性。然而，我們還觀察到更高濃度（大于20μM）的TAM可對HepG2細胞產(chǎn)生毒性作用，抑制其增殖（數(shù)據(jù)未列出）。

3 討論

TAM是一種非類固醇類雌激素受體拮抗劑，作為乳腺癌內(nèi)分泌治療金標準的藥物應(yīng)用于臨床已超過30年，但長期服用TAM也會產(chǎn)生一系列的毒副作用，包括低血糖癥、高甘油三酯血癥、血漿膽固醇水平改變以及一些肝臟疾病[4]。臨床研究表明TAM治療與NAFLD的發(fā)生有關(guān)[6]，動物實驗也進一步證實TAM可誘發(fā)NAFLD[7]。在本研究中，我們通過體外實驗證實了TAM可促進細胞脂肪變性。

NAFLD以肝細胞內(nèi)脂肪即甘油三酯積聚為主要特征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎及其相關(guān)的肝硬化。關(guān)于NAFLD發(fā)病機制，目前國內(nèi)外普遍認可的是Day和James提出的“二次打擊”學(xué)說[8]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白屬于核轉(zhuǎn)錄因子家族，有三個成員：即SREBP-1a、SREBP-1c和SREBP-2[9]。SREBP-1c是調(diào)控肝臟脂肪酸合成的主要亞型（90%）[10]。SREBP-1c可激活脂肪酸合成的關(guān)鍵酶基因，包括ATP檸檬酸裂解酶、乙酰輔酶A羧化酶、FAS、SCD及甘油-3-磷酸酰基轉(zhuǎn)移酶等[11]。目前，關(guān)于TAM對動物肝臟SREBP-1c及其下游基因影響的研究，其結(jié)果不同。Lelliott等發(fā)現(xiàn)在TAM處理過的大鼠肝臟SREBP1 mRNA水平無變化，而FAS和SCD mRNA水平下降[7]。經(jīng)TAM處理后FAS mRNA水平上升200%，但蛋白表達未改變，而SCD mRNA水平下降60%[5]。Gudbrandsen等認為TAM并不影響大鼠肝臟SCD活性及其mRNA水平，但TAM可以使FAS活性下降，并且下調(diào)FAS mRNA水平[12]。我們研究發(fā)現(xiàn)，TAM可以增加HepG2細胞SREBP-1c、FAS和SCD蛋白表達。我們推測，TAM可能是通過提高SREBP-1c轉(zhuǎn)錄活性，進一步上調(diào)其下游脂肪生成基因的表達，從而導(dǎo)致細胞內(nèi)甘油三酯積聚。

TAM增加肝細胞內(nèi)脂質(zhì)積累與線粒體脂肪酸β氧化受阻有關(guān)嗎？CPT1是線粒體脂肪酸β氧化的限速酶[13]。Cole等認為TAM對小鼠肝臟CPT1 mRNA水平無顯著影響[5]。TAM不會改變肝臟β氧化降解物乙酰輔酶A和丙酰輔酶A水平[12]。在目前的體外研究中，我們也沒有發(fā)現(xiàn)TAM對于HepG2細胞CPT1蛋白表達有影響。因此，TAM可能不是通過抑制線粒體脂肪酸β氧化加速肝細胞中甘油三酯積聚的。

有研究顯示，TAM處理后肝臟甘油三酯水平升高并伴隨著血清甘油三酯水平下降[12]。脂肪酸能夠通過酯化作用轉(zhuǎn)變成甘油三酯，以VIDL的形式分泌出細胞。載脂蛋白B100是VLDL最重要的蛋白組分。MTP是VLDL組裝和分泌的關(guān)鍵因子，它可結(jié)合甘油三酯等多種脂質(zhì)分子，并將這些脂質(zhì)呈遞給載脂蛋白B100[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TAM不會抑制HepG2細胞MTP表達。因此，我們認為TAM引起的HepG2細胞甘油三酯積聚可能與VLDL的組裝和分泌無關(guān)。相反的是，我們觀察到TAM可以增加HepG2細胞中MTP蛋白表達，可能是由于TAM引起甘油三酯積聚，通過反饋調(diào)節(jié)機制刺激了MTP的表達。

[1]Boyle P.Triple-negative breast cancer：epidemiological considerations and recommendations.Ann Oncol，2012，23（Suppl 6）：vi7-vi12.

[2]Harrell JC，Dye WW，Harvell DM，et al.Estrogen insensitivity in a model of estrogen receptor positive breast cancer lymph node metastasis.Cancer Res，2007，67（21）：10582-10591.

[3]Tomao F，Spinelli G，Vici P，et al.Current role and safety profile of aromatase inhibitors in early breast cancer.Expert Rev Anticancer Ther，2011，11（8）：1253-1263.

[4]Lee MH，Kim JW，Kim JH，et al.Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen.Toxicol Lett，2010，199（3）：416-424.

[5]Cole LK，Jacobs RL，Vance DE.Tamoxifen induces triacylglycerol accumulation in the mouse liver by activation of fatty acidsynthesis.Hepatology，2010，52（4）：1258-1265.

[6]Akhondi-Meybodi M，Mortazavy-Zadah MR，Hashemian Z，et al.Incidence and risk factors for non-alcoholic steatohepatitis in females treated with tamoxifen for breast cancer.Arab J Gastroenterol，2011，12（1）：34-36.

[7]Lelliott CJ，López M，Curtis RK，et al.Transcirpt and metabolite analysisoftheeffectsoftamoxifeninratliverreveals inhibition of fatty acid synthesis in the presence of hepatic steatosis.FASEB J，2005，19（9）：1108-1119.

[8]Tilg H，Moschen AR.Evolution of inflammation in nonalcoholic fattyliverdisease：themultipleparallelhitshypothesis. Hepatology，2010，52（5）：1836-1846.

[9]張艷，郭傳勇.非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機制及其相關(guān)基因研究進展.實用肝臟病雜志，2013，16（4）：375-377.

[10]Pettinelli P，Obregón AM，Videla LA.Molecular mechanisms of steatosis in nonalcoholic fatty liver disease.Nutr Hosp，2011，26（3）：441-450.

[11]Strable MS，Ntambi JM.Genetic control of de novo lipogenesis：role in diet-induced obesity.Crit Rev Biochem Mol Biol，2010，45（3）：199-214.

[12]Gudbrandsen OA，Rost TH，Berge RK.Causes and prevention of tamoxifen-induced accumulation of triacylglycerol in rat liver.J Lipid Res，2006，47（10）：2223-2232.

[13]Serviddio G，Giudetti AM，Bellanti F，et al.Oxidation of hepatic carnitine palmitoyl transferase-I（CPT-I）impairs fatty acid beta-oxidation in rats fed a methionine-choline deficient diet. PLoS One，2011，6（9）：e24084.

[14]OliveiraCP，StefanoJT，CavaleiroAM，etal.Associationof polymorphismsofglutamate-cysteinligaseandmicrosomal triglyceride transfer protein genes in non-alcoholic fatty liver disease.J Gastroenterol Hepatol，2010，25（2）：357-361.

（收稿：2013-10-15）

（校對：陳從新）

Tamoxifenpromotes lipidaccumulationinHepG2 cells invitro

Zhao Fei，Xie Ping，Jiang Jiali，et al.
Department of Gastroenterology，Tongren Hospital，Capital Medical University，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate the effect of tamoxifen（TAM）on steatosis in HepG2 cells in vitro and on the expression of key regulators involved in lipid metabolism in the cells.MethodsA cell model of steatosis was induced in HepG2 cells in vitro with oleic acid（OA）at 50 μmol/L；HepG2 cells were then subjected to different concentrations of TAM（5 to 20 μmol/L）at the presence of OA for 72 h；Intracellular lipid accumulation was assessed by oil red O staining and measurement of triglyceride；The expression of sterol regulatory elementbinding protein-1c（SREBP-1c），fatty acid synthase（FAS），steroyl-CoA desaturase（SCD），carnitine palmitoyltransferase 1（CPT1）and mitochondrial trifunctional protein（MTP）was determined by Western blot；Cell viability was detected by cell counting Kit-8 assay.ResultsAfter incubation for 72 h，the intracellular triglyceride in control group was（16.53±0.17）mg/100 mg protein，similar to that of cells treated with 5μmol/L TAM，however，the intracellular triglyceride was increased by 31%[（21.57±0.16）mg/100 mg protein]and 44%[（23.82±0.44）mg/100 mg protein]in cells treated with 10 μmol/L and 20 μmol/L of TAM，respectively（P＜0.05）；TAM treatment（5 to 10 μmol/L）significantly increased the expression of SREBP-1c，F(xiàn)AS，SCD and MTP without affecting the expression of carnitine palmitoyltransferase 1（CPT1）in HepG2 cells；TAM did not affect HepG2 viability.ConclusionsTAM promotes OA-induced cell steatosis，probably by up-regulation of SREBP-1c，F(xiàn)AS and SCD，thus increases fatty acid synthesis in the cells.

HepG 2 cells；Tamoxifen；Steatosis；Triglyceride；Fatty acid synthesis

10.3969/j.issn.1672-5069.2014.01.009

肝臟保護與再生調(diào)節(jié)北京市重點實驗室課題（2013年資助）

100730北京市首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院消化科（趙斐，姜佳麗，展玉濤）；軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所（謝萍，張令強）；首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞生物學(xué)系（安威）

趙斐，女，26歲，碩士研究生。主要從事非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機制研究。E-mail：fayefly.future@163.com

展玉濤，E-mail：yutaozhan@263.net