趙 敏 汪開(kāi)毓, 2 王 均, 2 陳德芳 黃凌遠(yuǎn), 2 王浩丞

?

趙 敏1汪開(kāi)毓1, 2王 均1, 2陳德芳1黃凌遠(yuǎn)1, 2王浩丞1

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚(yú)病研究中心, 雅安 625014; 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 雅安 625014)

目前, 在魚(yú)病的防治過(guò)程中, 養(yǎng)殖業(yè)者為減少損失, 首先采用的對(duì)策就是使用抗菌藥物, 但由于水產(chǎn)病原菌日趨嚴(yán)重的耐藥性, 使得抗菌藥難以達(dá)到預(yù)期的治療效果[10-12], 從而又給魚(yú)病的防治帶來(lái)了巨大的困難。其中, 四環(huán)素類藥物為一種廣譜抗生素, 通過(guò)干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成起到抑菌作用[13], 可用于防治魚(yú)類的多種細(xì)菌性疾病, 而因臨床上對(duì)該類抗生素的不合理使用, 使得魚(yú)類病原菌對(duì)此類抗生素的耐藥性變的尤為突出[10—12]。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.2 主要試劑

藥敏紙片(四環(huán)素30 μg/片, 強(qiáng)力霉素30 μg/片)和MH培養(yǎng)基購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司, 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-2)、2×Master Mix和感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生物科技有限公司, 克隆載體pMD19-T、DNA Marker及DNA純化回收試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司, 氨芐青霉素鈉購(gòu)自上海生工生物技術(shù)有限公司, 瓊脂糖購(gòu)自廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司, 鹽酸四環(huán)素(98.5%)和鹽酸多西環(huán)素(98%)由四川省民生藥業(yè)有限責(zé)任公司惠贈(zèng)。

1.3 菌株培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下, 取低溫保存的維氏氣單胞菌和質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922接種于MH肉湯中, 28℃恒溫?fù)u床120 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜后, 采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液濁度為0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?。然? 參照CLSI[13]推薦的紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法(藥物濃度由128 μg/mL 2倍稀釋至0.25 μg/mL)對(duì)所有菌株進(jìn)行藥物敏感性分析; 結(jié)果參照2008年版CLSI抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.4 tet基因片段獲得與分析

按照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-2)的操作說(shuō)明提取菌體基因組DNA, –20 ℃保存?zhèn)溆?。四環(huán)素類耐藥基因的引物序列參照Nawaz,.[14]的報(bào)道, 詳見(jiàn)表1。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。以維氏氣單胞菌基因組DNA為模板, 分別用相應(yīng)的引物擴(kuò)增目標(biāo)基因、、、和; PCR反應(yīng)體系為50 μL: 2×Master Mix 25 μL, DNA模板2.0 μL, 上、下游引物各1.0 μL, 無(wú)菌超純水21 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性2min, 94℃ 20s, 53℃10s, 65℃ 45s共30個(gè)循環(huán), 最后65℃延伸4min。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。采用DNA純化回收試劑盒回收各個(gè)基因的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物(每個(gè)基因隨機(jī)選取其中的5個(gè), 不足5個(gè)則全部回收), 相關(guān)操作參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。構(gòu)建pMD19-T-重組質(zhì)粒, 然后提取質(zhì)粒, 采用對(duì)應(yīng)引物進(jìn)行PCR鑒定, 將鑒定為陽(yáng)性的質(zhì)粒送往公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列間相似性分析, 再利用NCBI中的 Blastn系統(tǒng)進(jìn)行序列的相似性搜索, 并使用Clustal X 2.0和Mega 4.0軟件對(duì)基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 四環(huán)素耐藥基因擴(kuò)增引物

2 結(jié)果

2.1 藥物敏感性測(cè)試結(jié)果

在本試驗(yàn)中同時(shí)采用了紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法來(lái)測(cè)定維氏氣單胞菌的藥物敏感性, 參照吳俊偉[16]所描述的方法, 以紙片擴(kuò)散法中抑菌圈的大小作為評(píng)價(jià)維氏氣單胞菌藥物敏感性的主要依據(jù), 在進(jìn)行耐藥水平最終結(jié)果判定的時(shí)候, 對(duì)抑菌圈顯示為中介, 而值較大的菌株判定為耐藥, 對(duì)抑菌圈遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)而值偏大的菌株判定為敏感。最終得出42株維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素類的藥物敏感性結(jié)果(表2、表3)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 tet基因的克隆與分析

經(jīng)測(cè)序,、、和基因片段大小分別為211、391、891和744 bp, 與預(yù)期結(jié)果相符。使用DNAMAN軟件分別對(duì)5個(gè)、2個(gè)、4個(gè)和2個(gè)基因片段進(jìn)行多序列比對(duì)分析, 結(jié)果顯示其一致性均為100%。然后將上述4類基因片段序列在NCBI中的 Blastn系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析, 結(jié)果顯示:、、和基因片段分別與GenBank中登陸的多個(gè)基因的同源性為100%。

圖1 tetA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 tetB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

在GenBank中分別下載多個(gè)、、和基因用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1-4)。結(jié)果顯示基因與存在于點(diǎn)狀氣單胞菌()pFBAOT6質(zhì)粒(GenBank登錄號(hào): 51492513)中的基因, 大腸桿菌O69 (serotype O69)質(zhì)粒介導(dǎo)的基因(GeneBank登錄號(hào): 227434002)、大腸桿菌Q19中的基因(GeneBank登錄號(hào): 393195318)、肺炎克雷伯菌()pKPI-6質(zhì)粒(GenBank登錄號(hào): 394557614)中的基因、蠟樣芽胞桿菌()中的基因(GenBank登錄號(hào): 242277425)聚為一簇;基因與來(lái)自福氏志賀氏菌()中質(zhì)粒介導(dǎo)的基因(GenBank登錄號(hào): 12054718)、大腸桿菌pTC1質(zhì)粒中的基因(GenBank登錄號(hào): CP000913.1)、多殺巴斯的桿菌()中的基因(GenBank登錄號(hào)分別為: 336087901、EU252517.1)、沙門氏菌()質(zhì)粒介導(dǎo)的基因(GenBank登錄號(hào): 353467616、HQ331538.1)等聚為一簇;基因與大腸桿菌中的基因(GenBank登錄號(hào)分別為: 190887129、190887131、190887127、190887125)、沙門氏菌中的基因(GenBank登錄號(hào): GU987054.1)以及plPO2T質(zhì)粒中的基因(GenBank登錄號(hào): 21735067)聚為一簇;基因則與來(lái)自殺鮭氣單胞菌()中的基因(GenBank登錄號(hào)分別為: 113129387、145301211)聚為一簇。

3 討論

在本研究中, 采用了紙片擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法對(duì)42株維氏氣單胞菌進(jìn)行了藥物敏感性測(cè)試, 兩種方法所得出的結(jié)果并不完全一致, 為了能夠確定最終的結(jié)果, 因此參考吳俊偉[15]所提出的方法, 以紙片擴(kuò)散法中抑菌圈的大小作為評(píng)價(jià)菌株耐藥性的主要依據(jù), 參考值進(jìn)行評(píng)判, 對(duì)抑菌圈中介, 而值較大的菌株判定為耐藥, 對(duì)抑菌圈遠(yuǎn)大于標(biāo)準(zhǔn)而值偏大的菌株判定為敏感。最終得出受試菌株對(duì)四環(huán)素耐藥的共有28株, 耐藥率為66.67%; 對(duì)強(qiáng)力霉素耐藥的共有24株, 耐藥率為57.14%, 明顯低于四環(huán)素。但從敏感菌株來(lái)看, 對(duì)四環(huán)素和強(qiáng)力霉素敏感的菌株均為10株, 敏感率為23.80%, 兩者沒(méi)有差別, 這說(shuō)明了四川地區(qū)的維氏氣單胞菌對(duì)于四環(huán)素和強(qiáng)力霉素的耐藥性已經(jīng)達(dá)到了非常嚴(yán)重的水平。

在革蘭氏陰性菌中, 細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥機(jī)制主要有兩種, 一種是核糖體保護(hù)蛋白, 該蛋白能保護(hù)核糖體免受四環(huán)素類藥物的作用從而產(chǎn)生耐藥[16]; 另一種是主動(dòng)外排作用, 通過(guò)外排蛋白將四環(huán)素排出胞外, 細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度因此降低, 核糖體因此受到保護(hù), 從而產(chǎn)生了耐藥性, 這是最早被研究的一種耐藥機(jī)制[17], 也是本研究中被證明存在于維氏氣單胞菌中的一種耐藥機(jī)制。外排蛋白屬于主要異化超家族(Major facilitator superfamily, MFS)中的一員[18]。目前, 已有超過(guò)20種不同的四環(huán)素外排蛋白被發(fā)現(xiàn), 這些蛋白被分為6個(gè)不同的類群[17],、、、和基因所編碼的外排蛋白屬于該6個(gè)類群中的第1類群[19], 均發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陰性菌中[17, 19]; 該類群蛋白具有12個(gè)跨膜α-螺旋, 其四環(huán)素抗性蛋白具有41%—78%的氨基酸同源性, 而它們的四環(huán)素阻抑蛋白具有37%—88%的氨基酸同源性[20]。在氣單胞菌中,、、、和基因已經(jīng)先后被證實(shí)存在于該屬中, 并且發(fā)現(xiàn)基因在該5種耐藥基因中檢出率最高[21-24], 說(shuō)明該基因是介導(dǎo)氣單胞菌分離株對(duì)四環(huán)素類藥物耐藥的優(yōu)勢(shì)基因。Nawaz,.[14]對(duì)分離自鯰魚(yú)的81株耐四環(huán)素的維氏氣單胞菌進(jìn)行了相關(guān)研究, 發(fā)現(xiàn)、、、和檢出率分別為3.70% (3/81)、28.40%(23/81)、2.47% (2/81)、2.47%(2/81)、90.12% (73/81), 其中基因的檢出率顯著高于其他4個(gè)基因, 為其優(yōu)勢(shì)基因, 符合上述觀點(diǎn)。然而, Jacobs,.[25]在對(duì)37株分離自南非水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的氣單胞菌的研究中, 以及 Kim,.[26]對(duì)8株分離自韓國(guó)的耐四環(huán)素殺鮭氣單胞菌的研究中都發(fā)現(xiàn)基因在這些菌株中檢出率最高。在本研究中, 同樣發(fā)現(xiàn)四環(huán)素耐藥的菌株基因檢出率最高, 且明顯高于其他4個(gè)基因, 而基因僅在2株菌中被檢測(cè)到, 與最初的研究結(jié)果存在差異; 這說(shuō)明在維氏氣單胞菌中, 四環(huán)素類耐藥基因的流行存在地域性差異。

表2 42株維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

注: S. 敏感; I. 中介; R. 耐藥

Note: S. Sensitive; I. Intermediate; R. Resistant

圖3 tetC基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖4 tetE基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

同時(shí), 本研究還發(fā)現(xiàn)在16和29號(hào)菌株中同時(shí)檢測(cè)到和, 在8號(hào)菌株中同時(shí)檢測(cè)到、和; 關(guān)于一株菌中同時(shí)檢測(cè)出幾種四環(huán)素類耐藥基因的情況, 在Nawaz,.[15], Schmidt,.[23]以及?í?ekA,.[25]各自的研究中已有報(bào)道。此外, 我們的研究還發(fā)現(xiàn)在耐藥菌株4、10、12中并未檢測(cè)到上述5種耐藥基因, 說(shuō)明在維氏氣單胞菌中可能還存在其他的四環(huán)素耐藥機(jī)制, 有待進(jìn)一步研究。

表3 42株維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的敏感性試驗(yàn)結(jié)果

表4 各基因的檢出率

在本研究中, 首次在國(guó)內(nèi)維氏氣單胞菌分離株中檢測(cè)到、、和基因, 為進(jìn)一步研究我國(guó)境內(nèi)的維氏氣單胞菌的耐藥機(jī)制提供了一定的理論依據(jù); 同時(shí), 本研究的結(jié)果也突出了目前我國(guó)水產(chǎn)病原菌耐藥性的嚴(yán)重性。因此, 如何防止水產(chǎn)病原菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播, 以及在魚(yú)病的防治過(guò)程中如何應(yīng)對(duì)因病原菌耐藥性而造成的困難值得廣大學(xué)者共同關(guān)注。

[1] Roberts M, Enoch D, Harris K,biovar sobria bacteraemia with septic arthritis confirmed by 16S rDNA PCR in an immunocompetent adult [J]., 2006, 55(2): 241—243

[3] Qin G M, Zhang X J, Chen C Z,Infection offrom diseasedL. and the biological characteristics of its pathogen [J]., 2008, 36(19): 8115—8117 [秦國(guó)民, 張曉軍, 陳翠珍, 等. 錦鯉維氏氣單胞菌感染癥及其病原微生物學(xué)特性研究. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(19): 8115—8117]

[4] Ma Z H, Yang H, Li T L,Isolation and identification of pathogenicisolated from infected Siberian sturgeon () [J]., 2009, 49(10): 1289—1294 [馬志宏, 楊慧, 李鐵梁, 等. 西伯利亞鱘()致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定. 微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(10): 1289—1294]

[5] Loch T P, Faisal M. Infection of Lake Whitefish () with Motilespp. in the Laurentian Great Lakes [J]., 2010, 36(1): 6—12

[6] Tang Y, Zheng K D, Zhu C K,Identification and drug sensitivity test of pathogen for tail-rot disease of the fish,[J], 2010, 40(4): 50—55 [唐毅, 鄭凱迪, 朱成科, 等. 華鯪爛尾病病原的分離鑒定及藥敏分析. 淡水漁業(yè), 2010, 40(4): 50—55]

[7] Gong Q, Gao S Q, Shan X F,Isolation and identification of pathogenicfrom[J]., 2010, 32(12): 981—983 [龔倩, 高淑琴, 單曉楓, 等. 框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2010, 32(12): 981—983]

[8] Huang X, Wang K, Du Z J,Identification, isolation and in vitro antimicrobial susceptibility testing of Aeromonas veronii associated with an acute death of Channel Catfish () in China [J]., 2010, 9(14): 2161—2164

[9] Li A H. Antibacterial drugs used in aquculture and drug resistance of fish bacterial pathogens [J]., 2002, 9(1): 87—91[李愛(ài)華. 水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗菌藥物及細(xì)菌耐藥性. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2002, 9(1): 87—91]

[10] Li A H, Cai T Z, Wu Y S,Investigation on drug resistangceof fish bacterial pathogenin China [J]. 2001, 28(1): 58—63 [李愛(ài)華, 蔡桃真, 吳玉深, 等. 我國(guó)魚(yú)類病原——嗜水氣單胞菌的耐藥性研究. 微生物學(xué)通報(bào), 2001, 28(1): 58—63]

[11] Lin J C, Luo Z J, Shu G,Investigationon drug resistance of clinical isolates fromon Antibiotics [J]., 2009, 37(15): 7024—7025 [林居純, 羅忠俊, 舒剛, 等. 嗜水氣單胞菌臨床分離菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性調(diào)查. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 37(15): 7024—7025]

[12] Chopra I, Roberts M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance [J]., 2001, 65(2): 232

[13] ClSI. Methods for Broth Dilution Susceptibility Testing of Bacteria Isolated from Aquatic Animal; Approved Guideline. CLSI document M49-A [M]. CLSI. 2006

[14] Nawaz M, Sung K, Khan S A,Biochemical and molecular characterization of tetracycline-resistantisolates from catfish [J]., 2006, 72(10): 6461

[15] Wu J W. Resistance level offrom pigs to fluoroquinolones in Chongqing [D]. Ya'an Sichuan, Sichuan Agricultural University. 2011 [吳俊偉. 動(dòng)物源大腸埃希菌氟喹諾酮類藥物多重耐藥機(jī)制與耐藥水平相關(guān)性研究. 四川雅安, 四川農(nóng)業(yè)大學(xué). 2011]

[16] Kobayashi T, Suehiro F, Cach Tuyen B,Distribution and diversity of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection proteins in Mekong river sediments in Vietnam [J]., 2007, 59(3): 729—737

[17] Alekshun M N, Levy S B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance [J]., 2007, 128(6): 1037—1050

[18] Kumar A, Schweizer H P. Bacterial resistance to antibiotics: active efflux and reduced uptake [J]., 2005, 57(10): 1486—1513

[19] Guillaume G, Ledent V, Moens W,Phylogeny of efflux-mediated tetracycline resistance genes and related proteins revisited [J]., 2004, 10(1): 11—26

[20] Feng X, Han W Y, Lei L C. Advanced research in the bacterial resistance mechanisms of tetracycline [J]., 2004, 38(2): 38—42 [馮新, 韓文瑜, 雷連成. 細(xì)菌對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥機(jī)制研究進(jìn)展. 中國(guó)獸藥雜志, 2004, 38(2): 38—42]

[21] Agers? Y, Bruun M S, Dalsgaard I,The tetracycline resistance gene(E) is frequently occurring and present on large horizontally transferable plasmids inspp. from fish farms [J]., 2007, 266(1): 47—52

[22] Schmidt A S, Bruun M S, Dalsgaard I,Incidence, distribution, and spread of tetracycline resistance determinants and integron-associated antibiotic resistance genes among motile Aeromonads from a fish farming environment [J]., 2001, 67(12): 5675—5682

[23] Jun J W, Kim J H, Gomez D K,Occurrence of tetracycline-resistantinfection in Korean cyprinid loach () [J]., 2010, 4(9): 849—855

[24] ?í?ek A, Dolejská M, Sochorová R,Antimicrobial resistance and its genetic determinants in Aeromonads isolated in ornamental (koi) carp () and common carp () [J]., 2010, 142(3): 435—439

[25] Jacobs L, Chenia H Y. Characterization of integrons and tetracycline resistance determinants inspp. isolated from South African aquaculture systems [J]., 2007, 114(3): 295—306

[26] Kim J H, Hwang S Y, Son J S,Molecular characterization of tetracycline-and quinolone-resistantisolated in Korea [J]., 2011, 12(1): 41—48

Tetracycline antibiotics resistance and its genetic determinants inisolated from Channel Catfish ()

Zhao Min1, Wang Kai-Yu1,2, Wang Jun1,2, Chen De-Fang1, Huang Ling-Yuan1,2and Wang Hao-Cheng1

(1. Fisheries Department of Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China; 2. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

Channel catfish ();; Tetracycline; Doxycycline; Drug resistance gene

2012-12-14;

2013-10-19

教育部《長(zhǎng)江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃》創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(IRT0848)資助

趙敏(1987—), 男, 在讀碩士; 研究方向?yàn)轸~(yú)病與漁藥。E-mail: 365794952@qq.com

汪開(kāi)毓(1955—), 男, 教授, 博導(dǎo); Tel: 0835-2885753; E-mail: kywangsicau@126.com

S941.4

A

1000-3207(2014)02-0386-07

10.7541/2014.55