蘇婷婷，劉俊渤?，唐珊珊，靳瑞發(fā)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.內(nèi)蒙古赤峰學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，赤峰024000）

分子印跡技術(shù)是指以目標(biāo)分子為印跡分子，制備對(duì)該分子具有特異識(shí)別性分子印跡聚合物（MolecularImprinted Polymers，MIPs）的過程。 MIPs制備主要依靠印跡分子與功能單體之間的相互作用，因此，印跡分子與單體的反應(yīng)比例將決定著MIPs的識(shí)別性能。目前，MIPs制備中功能單體與印跡分子的反應(yīng)比例主要是通過核磁共振光譜法、紫外分光光度法或比較不同反應(yīng)比例MIPs的吸附量［1－3］進(jìn)行確定。 為提高 MIPs的合成效率，越來越多研究者以計(jì)算機(jī)模擬取代實(shí)驗(yàn)［4－6］，為優(yōu)化分子印跡體系提供了理論依據(jù)。

苯巴比妥（PHN）由于可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)而被濫用為動(dòng)物飼料添加劑，有致癌致畸等副作用［7］。PHN常用的檢測(cè)方法需要通過預(yù)處理把其從混合樣品中分離出來。MIPs特異吸附性強(qiáng)，是較好的選擇性吸附材料，在很多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［8－9］。目前，利用MIPs印跡識(shí)別PHN研究主要采用了兩步溶脹法，合成的 MIPs粒徑處在微米級(jí)［10－11］。 相比之下，納米級(jí)的MIPs具有比表面積大、吸附容量高及選擇性能好等優(yōu)點(diǎn)［12］。本文借助量子化學(xué)理論優(yōu)化了PHN印跡分子與甲基丙烯酸（MAA）單體的反應(yīng)比例，在最佳比例下采用沉淀聚合法合成了納米級(jí)苯巴比妥分子印跡聚合物（PHN－MIPs），并對(duì)其吸附性能進(jìn)行了研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 理論計(jì)算方法 PHN與功能單體間主要通過氫鍵進(jìn)行印跡聚合反應(yīng)，而雜化密度泛函M062X在氫鍵計(jì)算方面優(yōu)于其它密度泛函［13］。因此，本文借助于 Gaussian 09程序 Revision A.02版軟件［14］，在 M062X 理論及三種基組（6－31g （d，p）、6－31g＋＋（d，p）、6－31g＋＋＋（d，p））下進(jìn)行 PHN（圖1A）結(jié)構(gòu)優(yōu)化計(jì)算，結(jié)果列于表1。表1數(shù)據(jù)表明，M062X理論下三種基組間鍵長(zhǎng)與鍵角的差值分別在 0.0001～0.0010 與 0～0.3 范圍，這說明基組大小沒有明顯引起分子結(jié)構(gòu)變化。同時(shí)，M062X理論下PHN分子結(jié)構(gòu)理論數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)值［15］接近，鍵長(zhǎng)與鍵角差值分別在 0.0001～0.0016 與 0～1.6 間，均在允許誤差范圍之內(nèi)，證明了M062X方法的可行性。因此，本研究選取 M062X／6－31g （d，p）方法優(yōu)化PHN、MAA（圖1B）及其復(fù)合物的幾何構(gòu)型。

圖1 PHN（A）與 MAA（B）分子結(jié)構(gòu)

表1 密度泛函理論M062X水平下的PHN結(jié)構(gòu)參數(shù)與實(shí)驗(yàn)值

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 苯巴比妥（PHN）：標(biāo)準(zhǔn)品，中國(guó)藥品生物制品檢定所；甲基丙烯酸（MAA）：分析純，天津化學(xué)有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGMA）：分析純，上海晶純?cè)噭┯邢薰?；偶氮二異丁腈（AIBN）：分析純，天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；乙腈、甲醇與乙酸：分析純，北京化工廠。

SHZ－88水浴恒溫振蕩器：金壇市開發(fā)區(qū)吉特實(shí)驗(yàn)儀器廠；JSM－5600掃描電子顯微鏡：日本JEOL電子株式會(huì)社；TU－1901雙光束紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；DZF－6062真空干燥箱：上海－恒科儀器有限公司；Spectrum 100傅里葉紅外光譜儀：上海珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 分子印跡聚合物的制備 將 0.0232 g（0.1 mmol））PHN、0.0516 g（0.6 mmol）MAA 溶于40 mL乙腈中，超聲溶解后于室溫放置24 h，加入0.5943 g（3.0 mmol）EGMA 和 0.020 gAIBN，超聲0.5 h后除氧密封，60℃恒溫水浴中反應(yīng)24 h后得到沉淀聚合物；用體積比為8∶2的甲醇－乙酸混合溶液洗脫聚合物中的 PHN，蒸干至恒重，得到PHN－MIPs。在不加印跡分子的前提下合成NIPs，步驟同上。

采用JSM－5600掃描電鏡觀測(cè)聚合物微球的大小及形貌。同時(shí)采用Spectrum 100紅外光譜儀對(duì)制備的聚合物進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.4 靜態(tài)與動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn) 靜態(tài)吸附試驗(yàn)：稱取0.020 g 的 PHN－MIPs（NIPs）于三角瓶中，分別加入 10 mL 不 同 濃 度 （0 、10、20、40、60、80、100 mg／L）的 PHN甲醇溶液，超聲混勻后置于28℃恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行24 h的印跡吸附。吸附后離心分離，取上層清液用0.22 μm的濾頭過濾，濾液通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，根據(jù)結(jié)合前后濃度的變化計(jì)算聚合物對(duì)目標(biāo)分子的結(jié)合量 Q。Q ＝ （C0－ C）V／W

其中Q為印跡聚合物對(duì)PHN的吸附量（mg／g），C0、C分別為PHN的初始濃度和吸附后的濃度（mg／L），V 為吸附溶劑的體積（mL），W 為聚合物微球的質(zhì)量（mg）。

動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)：稱取 0.020 g的 PHN－MIPs（NIPs），置于已知濃度PHN甲醇溶液中，測(cè)定不同時(shí)間段內(nèi)PHN甲醇溶液的吸光度，根據(jù)結(jié)合前后濃度的變化計(jì)算聚合物對(duì)目標(biāo)分子的結(jié)合量Q。

2 結(jié)果與討論

2.1 PHN與MAA幾何結(jié)構(gòu)分析 在密度泛函理論 M062X／6－31g（d，p）下優(yōu)化 PHN 與 MAA 分子結(jié)構(gòu)，并分析其最高占據(jù)分子軌道（HOMO）與最低未占據(jù)分子軌道（LUMO），結(jié)果見圖2。前線軌道可以判斷分子的化學(xué)反應(yīng)活性與穩(wěn)定性。其中，最高占據(jù)軌道能量EHOMO反應(yīng)給電子能力，能量越高，給電子能力越強(qiáng)；反之，最低未占據(jù)軌道能量ELUMO越低，接受電子能力越強(qiáng)。由圖2可知，PHN的最高占據(jù)軌道能量EHOMO＝－8.417 eV，其主要位于苯環(huán)及嘧啶環(huán)上的C＝O上，是PHN的主要電子供體部分。最低未占據(jù)軌道能量ELUMO＝－0.342 eV，其主要位于嘧啶環(huán)上的內(nèi)酰胺基團(tuán)部分，是PHN的主要電子受體部分。同理，圖 2B中 MAA中－COOH基團(tuán)占據(jù)大部分的 HOMO軌道成分，而LUMO包含較多的－CH＝CH－軌道成分，還包含－COOH基團(tuán)，說明MAA的－COOH基團(tuán)既可以作為電子給體，又可作為電子受體。由于PHN的EHOMO為 －8.417 eV，高于 MAA 的 EHOMO（－8.940 eV），所以在形成氫鍵時(shí)PHN更容易給出電子，顯示出較高的反應(yīng)活性。

2.2 PHN與MAA復(fù)合物構(gòu)型優(yōu)化 印跡分子與功能單體處于合適反應(yīng)比例時(shí)，單體與印跡分子間產(chǎn)生較強(qiáng)相互作用，這種相互作用使得MIPs具有較高的印跡識(shí)別性能。因此，選取合適的印跡分子－單體反應(yīng)比例直接決定MIPs的穩(wěn)定性與選擇性。借助于 Gaussian 09軟件，利用自洽反應(yīng)場(chǎng)中的Tomasi極化連續(xù)模型模擬PHN印跡分子與MAA單體在60℃乙腈溶劑中相互作用過程。以相互作用位點(diǎn)數(shù)目越多，復(fù)合物越穩(wěn)定為原則，對(duì)復(fù)合物進(jìn)行比較，選取相互作用位點(diǎn)最多的印跡分子－單體復(fù)合物作為研究對(duì)象。PHN與MAA在不同反應(yīng)比例下的復(fù)合物構(gòu)型及其氫鍵鍵合數(shù)據(jù)見圖3。由圖3可知，PHN結(jié)構(gòu)中反應(yīng)位點(diǎn)為 H7、H8、N14、N15、O16、O17、O18，MAA 反應(yīng)位點(diǎn)為－COOH 基團(tuán)上的羰基氧原子與羥基氫原子。其中，MAA的C＝O作為電子供體與PHN電子受體N－H氫鍵鍵合，MAA的O－H作為電子受體與PHN電子供體C＝O氫鍵鍵合。如反應(yīng)比例為1∶6的復(fù)合物（圖3F），PHN的O16作為電子供體與MAA的電子受體H65、H89形成兩個(gè)氫鍵。PHN的H7作為電子受體與MAA的電子供體O51形成一個(gè)氫鍵。該結(jié)果與上述HOMO、LUMO結(jié)論一致。

從表2可以看到，隨PHN與MAA功能單體反應(yīng)比例的增加，分子間氫鍵相互作用位點(diǎn)數(shù)目也增加，即反應(yīng)比例為1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6時(shí)，PHN與MAA復(fù)合物的氫鍵作用位點(diǎn)數(shù)目分別為 2、4、5、6、7、8。 這說明印跡分子－單體復(fù)合物隨反應(yīng)比例增加，氫鍵相互作用越強(qiáng)，穩(wěn)定性越好。當(dāng)反應(yīng)比例增加至1∶7時(shí)，功能單體間相互作用，阻礙了印跡分子與功能單體間的氫鍵相互作用，最終導(dǎo)致反應(yīng)比例為1∶7的復(fù)合物氫鍵作用位點(diǎn)數(shù)目低于1∶6，穩(wěn)定性也隨之降低。因此，反應(yīng)比例為1∶6的印跡分子－單體復(fù)合物穩(wěn)定性最好，其作用位點(diǎn)及氫鍵鍵長(zhǎng)分別為：O39┅H8—N15（0.1742 nm）、O40—H41┅O17（0.1787 nm）、O51┅H7—N14（0.1741 nm）、O52—H53┅O18（0.1806 nm）、O64—H65┅O16（0.2136 nm）、O76—H77┅O18（0.1813 nm）、 O88—H89 ┅ O16 （0.1866 nm）、O100—H101┅O17（0.1802 nm），有望制備對(duì) PHN更高穩(wěn)定性、選擇性及吸附性的MIPs。

圖2 PHN（A）與MAA（B）的前線分子軌道分布圖

圖3 PHN與MAA在不同反應(yīng)比例下的復(fù)合物模型

表2 PHN與MAA在不同反應(yīng)比例下的氫鍵鍵合數(shù)據(jù)

2.3 不同反應(yīng)比例 PHN－MIPs（NIPs）的吸附性在上述模擬計(jì)算指導(dǎo)下，制備PHN與MAA在反應(yīng)比例為 1 ∶1、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7的 PHN－MIPs與NIPs，并測(cè)定其吸附性能（圖4）。PHN甲醇溶液的初始濃度為100 mg／L。由圖4可知，隨PHN與MAA反應(yīng)比例的增加，聚合物的吸附量也增大。當(dāng)反應(yīng)比例增加至1∶7時(shí)，PHN－MIPs的吸附量略有降低。因此，制備PHN－MIPs的最佳反應(yīng)比例為1∶6。該研究還表明，吸附實(shí)驗(yàn)與上述計(jì)算模擬結(jié)果一致。此外，所有比例下的PHN－MIPs的吸附能力明顯高于 NIPs，原因在于印跡分子參與了PHN－MIPs的合成，使得洗脫后的PHN－MIPs存在一個(gè)與印跡分子相匹配的“孔穴”，該孔穴結(jié)構(gòu)對(duì)PHN存在特異吸附能力，而NIPs只能進(jìn)行表面吸附。

圖4 不同反應(yīng)比例下PHN－MIPs與NIPs的吸附量

2.4 掃描電鏡表征 對(duì)以MAA為功能單體的PHN－MIPs和 NIPs進(jìn)行掃描電子顯微鏡表征（圖5）。由圖5可知乙腈溶劑中制備的PHN－MIPs（圖5A）與NIPs（圖5B）呈微球狀態(tài)，粒徑均一，且分散性良好。借助Nano Measurer 1.2軟件對(duì)聚合物微球進(jìn)行粒徑分布分析，結(jié)果如圖6。圖中粒徑分布結(jié)果表明 PHN－MIPs與 NIPs粒徑分別在180～360 nm（平均粒徑為 253 nm）與 140～310 nm（平均粒徑為 208 nm）范圍內(nèi)，優(yōu)于文獻(xiàn)［10］與［11］中通過兩步溶脹法合成的MIPs效果，且相比于NIPs，PHN－MIPs有更好的吸附容量。

圖5 PHN－MIPs（A）與 NIPs（B）的掃描電鏡圖

圖6 PHN－MIPs（A）與 NIPs（B）的粒徑分布圖

2.5 MIPs與NIPs的吸附性能研究 稱取相同量的PHN－MIPs或NIPs置入10 mL不同濃度的PHN甲醇溶液中，測(cè)定28℃下聚合物微球?qū)HN的吸附量，結(jié)果如圖7（A）。由圖7（A）可知相同溫度下PHN－MIPs與NIPs吸附量隨PHN初始濃度的增加而增加，當(dāng) PHN初始濃度達(dá) 120 mg／L時(shí)，PHN－MIPs與NIPs均達(dá)到最大飽和吸附量。此外，PHN－MIPs飽和吸附量為 8.2 mg／g，明顯高于 NIPs的最大飽和吸附量（3.5 mg／g），表現(xiàn)出很好的特異吸附性。

固定 PHN初始濃度，測(cè)定不同時(shí)間段內(nèi)PHN－MIPs與NIPs的吸附量，并繪制PHN－MIPs與NIPs的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，結(jié)果如圖7（B）。圖中PHN－MIPs與NIPs吸附量隨時(shí)間的增加而增加，吸附一定時(shí)間后達(dá)到平衡。此吸附過程分迅速吸附與緩慢吸附兩個(gè)階段。在初始階段，PHN－MIPs具有較多的吸附位點(diǎn)，吸附速率達(dá)60%；150 min后，PHN－MIPs對(duì)PHN的吸附進(jìn)入緩慢吸附階段，吸附速率達(dá)30%；300 min后，PHN－MIPs上所有吸附位點(diǎn)均被占據(jù)，此時(shí)吸附量達(dá)到最高。因此，利用分子印跡聚合物檢測(cè)PHN藥物殘留量的時(shí)間不得低于300 min。此外，與 PHN－MIPs相比，NIPs吸附速率僅達(dá)45%，且吸附平衡時(shí)間提前于240 min。

圖7 PHN－MIPs（NIPs）的吸附等溫線（A）與吸附動(dòng)力學(xué)曲線（B）

2.6 紅外光譜分析 紅外光譜可反映PHN－MIPs的結(jié)構(gòu)信息，當(dāng)功能單體MAA質(zhì)子受體C＝O或質(zhì)子給體O－H與印跡分子PHN質(zhì)子給體或質(zhì)子受體形成氫鍵時(shí)，使其特征吸收振動(dòng)峰移向較低頻率。圖8為PHN－MIPs、NIPs的紅外光譜圖，從圖中可以看出，PHN－MIPs和NIPs的紅外光譜相近，但單體MAA特征官能團(tuán)C＝O、O－H振動(dòng)峰的位置、強(qiáng)度與寬度有明顯差別。MAA單體未形成氫鍵時(shí) C＝O振動(dòng)吸收峰在 1770 cm－1處，而形成PHN－MIPs后，上述振動(dòng)吸收峰移至 1732 cm－1處，這是因MAA分子中C＝O與PHN的質(zhì)子給體N－H形成氫鍵所致，見圖3。圖中還可看到，NIPs在3026 cm－1處有O－H的彎曲振動(dòng)吸收峰，而MIPs共聚物中O－H吸收峰在2989 cm－1，其吸收峰不僅增強(qiáng)，且譜帶向低頻率方向紅移了37 cm－1，這表明單體MAA分子中的質(zhì)子給體O－H與PHN印跡分子的質(zhì)子受體C＝O可形成較強(qiáng)的氫鍵。

圖8 PHN－MIPs與NIPs的紅外光譜圖

3 小 結(jié)

以PHN為印跡分子，MAA為功能單體，采用量子化學(xué)模擬計(jì)算研究60℃乙腈中PHN印跡分子與MAA功能單體不同反應(yīng)比例時(shí)形成復(fù)合物的構(gòu)型、成鍵情況及印跡原理，闡明了PHN－MIPs印跡本質(zhì)及其印跡作用機(jī)理，優(yōu)化了印跡分子與單體反應(yīng)比例。按最佳反應(yīng)比例1∶6，采用沉淀聚合法制備的 PHN－MIPs呈微球形狀，粒徑在 180～360 nm范圍，20 mg PHN－MIPs的最大飽和吸附量為8.2 mg／g。 本研究為 PHN－MIPs的選擇性分離、富集和檢測(cè)樣品中的PHN提供了理論與實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。

［1］楊衛(wèi)海，嚴(yán)守雷，衛(wèi) 晨，等.沉淀聚合法制備三聚氰胺分子印跡聚合物微球［J］.高分子學(xué)報(bào)，2010， （10）： 1163－1169.

［2］辛 瑜，仝艷軍，楊海麟，等.不同功能單體合成的谷胱甘肽分子印跡聚合物的研究.［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2012，70（6）：803－811.

［3］劉俊渤，王艷玲，唐珊珊，等.恩諾沙星分子印跡聚合物的制備及表征［J］.中國(guó)獸藥雜志， 2014， 48（3）： 30－34.

［4］劉俊渤，唐珊珊，孫佳妮，等.環(huán)丙沙星與三氟甲基丙烯酸分子印跡自組裝體系的理論研究［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2013， 11（34）： 2566－2573.

［5］李文靜，胡艷云，韓 芳，等.三唑酮分子印跡預(yù)組裝體系的分子模擬與吸附性能［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（5）：1219－1225.

［6］孫佳妮，劉俊渤，唐珊珊，等.環(huán)丙沙星分子印跡聚合物自組裝體系的分子模擬［J］.中國(guó)獸藥雜志，2013，47（4）：29－34.

［7］張海棠，王自良，王艷榮.苯巴比妥在動(dòng)物生產(chǎn)中的非法使用及毒性作用［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2008， 36（4）： 29－31.

［8］Mujahid A，Iqbal N，Afzal A.Bioimprinting strategies：From soft lithography to biomimetic sensors and beyond［J］.Biotechnology Advances， 2013， 31（8）： 1435－1447.

［9］賀利民，劉開永，武 力，等.分子印跡固相萃取氣相色譜－質(zhì)譜法測(cè)定雞蛋中三聚氰胺［J］.中國(guó)獸藥雜志，2011，45（1）： 2－5.

［10］Hua K C， Zhang L， Zhang Z H， et al.Surface hydrophilic modification with a sugar moiety for a uniform－sized polymer molecularly imprinted for phenobarbital in serum ［J］.Acta Biomaterialia， 7（8）： 3086－3093.

［11］Hu S G， Wang S W， He X W.An amobarbital molecularly imprinted microsphere for selective solid－phase extraction of phenobarbital from human urine and medicines and their determination by high－performance liquid chromatography［J］.Analyst， 2003， 128： 1485－1489.

［12］Dai J D， Pan J M， Xu L C， et al.Preparation of molecularly imprinted nanoparticleswith superparamagnetic susceptibility through atom transfer radical emulsion polymerization for the selective recognition of tetracycline from aqueous medium［J］.Journal of Hazardous Materials， 2012， 205－206： 179－188.

［13］孫 濤，王一波.用GGA密度泛函及其長(zhǎng)程色散校正方法計(jì)算各類氫鍵的結(jié)合能［J］.物理化學(xué)學(xué)報(bào)，.2011，27（11）：2553－2558.

［14］Frisch M J， Trucks G W， Schlegel H B， et al.Gaussian 09［CP］.Revision B.04.Gaussian Inc： Pittsburgh， PA， 2009.

［15］Platteau C， Lefebvre J， Hemon S， et al.Structure determination of formsⅠ andⅡ of phenobarbital from X－ray power diffraction［J］.Acta Crystallogr Sect B： Struct Sci， 2005， 61（Pt1）：80－88.