文晶亮，李啟紅，李俊平，劉 丹，李 嶺，楊承槐，李慧姣，夏業(yè)才

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

gE蛋白是皰疹病毒家族中較為重要的糖蛋白之一，由位于US區(qū)的US8基因編碼。據(jù)報(bào)道皰疹病毒gE基因是皰疹病毒從視網(wǎng)膜、嗅覺(jué)上皮細(xì)胞、三叉神經(jīng)節(jié)侵入中樞神經(jīng)組織所必須的毒力基因，對(duì)皰疹病毒在體內(nèi)毒力表達(dá)、侵襲神經(jīng)核沿著神經(jīng)傳遞起著決定性的作用，另外還能促進(jìn)病毒在細(xì)胞之間擴(kuò)散［1－4］。 目前對(duì)人皰疹病毒、偽狂犬病毒、牛皰疹病毒等皰疹病毒糖蛋白gE基因及其編碼蛋白已有大量研究［5－7］，而對(duì)鴨瘟病毒 gE基因及其編碼蛋白尚未有深入的報(bào)道。因此，本研究PCR擴(kuò)增了DEV的gE基因完整開(kāi)放閱讀框（gE）和去信號(hào)肽的gE基因（gE’），分別克隆至真核表達(dá)載體pCDNA3.1，轉(zhuǎn)染 vero細(xì)胞，并應(yīng)用 RT－PCR 和間接免疫熒光檢測(cè)gE、gE’蛋白在vero細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，旨在探討gE蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)，為gE蛋白的功能研究、鴨瘟抗體檢測(cè)奠定基礎(chǔ)，為深入了解鴨瘟病毒感染的發(fā)病機(jī)理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒與細(xì)胞 鴨腸炎病毒AV1221株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏中心提供；vero細(xì)胞，由本實(shí)驗(yàn)室保存；E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)于天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 真核表達(dá)載體 pCDNA3.1，由本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18－T載體、Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、EcoRⅠ、XhoⅠ、MarkerⅣ、T4 DNA 連接酶，均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine 2000，購(gòu)自 Invitrogen 公司；OPTI－MEM?I培養(yǎng)液，購(gòu)自gibco?公司；FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光二抗，購(gòu)自美國(guó)sigma－aldrich公司；DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、TBD標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)于賽墨飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.1.3 試劑盒 高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司。

1.1.4 血清 雞抗DEV陽(yáng)性血清，由本實(shí)驗(yàn)室制備；TBD標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，購(gòu)于賽墨飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增鴨腸炎病毒AV1221株的gE基因完整ORF序列（gE）和去信號(hào)肽的gE基因（gE’）引物，由invitrogen公司合成。

針對(duì)gE的引物：

P1： 5’ －AAGAATTC ATGATGGTTACTTTTAT－3’，下劃線部分為酶切位點(diǎn)EcoR I；

P2：5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下劃線部分為酶切位點(diǎn)Xho I；

針對(duì)gE’的引物：

P11： 5’－AAGAATTCGACTATCATCAAGTGATT－3’，下劃線部分為酶切位點(diǎn)EcoR I；

P22： 5’－AACTCGAGTCAGATGCGGAAACTAGA－3’，下劃線部分為酶切位點(diǎn)Xho I；

1.2.2 DNA 模板提取 按參考文獻(xiàn)［8］進(jìn)行。

1.2.3 gE基因的克隆 PCR反應(yīng)體系：病毒DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物 P11 μL，下游引物 P21 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶0.125 μL，ddH2O 16.375 μL，總體積 25 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，46.2 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min 30 s，30 個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 去信號(hào)肽 gE 基因（gE’）序列的克隆 PCR

反應(yīng)體系：病毒 DNA 2 μL，dNTPs 2 μL，上游引物P111 μL，下游引物 P221 μL，10 ×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚 合 酶 0.125 μL， ddH2O 16.375 μL，總體積 25 μL。

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性40 s，47℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。 反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 gE基因測(cè)序及序列分析 PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收后，分別連接到pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，獲得重組質(zhì)粒 pMD18T－gE、pMD18T－ gE’。將酶切及PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD18T－gE、pMD18T－gE’送Invitrogen公司測(cè)序，并用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序正確的gE基因進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)gE基因編碼蛋白的功能。

1.2.6 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 gE基因測(cè)序正確后，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ分別雙酶切克隆質(zhì)粒 pMD18－gE、pMD18－gE’和載體 pCDNA3.1。回收、純化雙酶切g(shù)E、gE’基因和pCDNA3.1線性質(zhì)粒，并用T4 DNA連接酶使雙酶切g(shù)E、gE’基因分別與 pCDNA3.1線性質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化 E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’，進(jìn)行酶切及 PCR 鑒定。

1.2.7 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染前20 h，消化vero細(xì)胞，轉(zhuǎn)入6孔細(xì)胞板，每孔6×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞鋪板密度在75%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

Lipofectamine 2000／DNA復(fù)合物的制備：分別將 0.8 μg pCDNA3.1－ gE、pCDNA3.1－ gE’質(zhì)粒分別稀釋于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的終體積均為 50 μL，室溫孵育 5 min；2 μL Lipofectamine 2000分別稀釋于不含血清和抗生素的opti－DMEM中，使混合液的終體積均為50 μL，輕輕混勻，室溫孵育5 min；將50 μL Lipofectamine 2000稀釋液分別滴加到50 μL質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊混勻；室溫孵育20 min。

轉(zhuǎn)染 vero細(xì)胞：分別將 100 μL Lipofectamine 2000／DNA復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖動(dòng)使其均勻混合，置37℃培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，置37℃培養(yǎng)24 h后，用1%胎牛血清的M199培養(yǎng)基換液，置37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.8 mRNA檢測(cè) 參照試劑盒操作說(shuō)明，提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照Invitrogen M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶的說(shuō)明書(shū)操作：模板RNA 5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物 1 μL，dNTP（10 mmol／L）1 μL，DEPC 水補(bǔ)加至 12 μL，100℃ 水浴 5 min，馬上冰淬滅 1 min；短暫離心后加入 5×buffer 4 μL，DTT（0.1mol／L）2 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，輕輕混勻后 50℃水浴5 min；加入 M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，50 ℃水浴 50 min；70 ℃水浴15 min，冰淬滅；加入1 μL RNaseH，馬上進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)參照 1.2.3 和 1.2.4。

1.2.9 表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè) 應(yīng)用間接免疫熒光法檢測(cè)表達(dá)蛋白，方法如下：取出6孔細(xì)胞板，用pH為7.2的PBST溶液漂洗細(xì)胞1次，加入0.5 mL預(yù)冷的甲醇溶液，固定15 min；棄去甲醇溶液，室溫放置2～5 min自然晾干；用PBST洗1次；加入100倍稀釋的雞抗DEV陽(yáng)性血清，37℃孵育1 h，棄去DEV陽(yáng)性血清，每孔用含0.05%吐溫－20的PBST洗3次后，用PBST液洗2次；加500倍稀釋的兔抗雞熒光抗體，37℃溫箱中避光孵育1 h，每孔用含0.05%吐溫－20的PBST洗3次后，用PBST洗2次，在熒光顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié) 果

2.1 gE基因的 PCR擴(kuò)增 分別以 gE基因的P1／P2為引物、gE’基因的 P11／P22為引物，病毒 DNA為模板PCR擴(kuò)增gE、gE’基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見(jiàn)約1400 bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。

圖1 gE和gE’基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 gE及gE’基因的克隆及酶切鑒定 回收純化后的gE、gE’PCR產(chǎn)物與pMD18－T連接，分別構(gòu)建克隆質(zhì)粒 pMD18T－gE、pMD18T－gE’，酶切、PCR 結(jié)果說(shuō)明所克隆序列與目的片段大小相近（圖2、圖 3）。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18T－gE酶切及PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD18T－gE’酶切及PCR鑒定結(jié)果

2.3 gE基因序列分析及編碼蛋白的功能預(yù)測(cè)

2.3.1 同源性分析結(jié)果 用NCBI網(wǎng)站的在線程序BLASTN對(duì)鴨瘟AV1221株gE基因序列與國(guó)內(nèi)分離強(qiáng)毒 CHv 株 （GenBank：EU071044.1）、 國(guó) 內(nèi) 疫 苗 株（GenBank：EU082088.2）和德國(guó)分離強(qiáng)毒 2085 株（GenBank：JF999965.1）基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：鴨瘟AV1221株gE基因序列與國(guó)內(nèi)分離強(qiáng)毒CHv株、國(guó)內(nèi)疫苗株同源性均為100%，與德國(guó)分離強(qiáng)毒2085株同源性為99%，143位堿基變異（T－C），導(dǎo)致第48位氨基酸由蘇氨酸（T）變成了異亮氨酸（I），此外，412位（G－A）和1351位（C－T）堿基同義突變。

2.3.2 信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果 用CBS網(wǎng)站的在線程序SignalP4.1對(duì)gE氨基酸序列進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：gE蛋白序列中預(yù)測(cè)到的C值、S值或Y值都大于臨界值，推測(cè)gE蛋白第1～22位氨基酸為信號(hào)肽（圖4）。

2.3.3 跨膜區(qū)的預(yù)測(cè)結(jié)果 本研究利用 TMHMM 2.0預(yù)測(cè)鴨瘟AV1221株gE蛋白的跨膜區(qū)，其結(jié)果顯示：gE蛋白在397～419位氨基酸有一個(gè)跨膜區(qū)，1～396位氨基酸位于胞膜外（胞外區(qū)），420～490位氨基酸位于胞膜內(nèi)（胞質(zhì)區(qū)）（圖5）。

圖4 gE氨基酸序列推倒肽鏈信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5 gE氨基酸序列推倒肽鏈跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’經(jīng) EcoRⅠ及 XhoⅠ雙酶切后分別得到約1400 bp和5400 bp的條帶，PCR鑒定結(jié)果也獲得了約1400 bp的條帶，說(shuō)明成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’（圖 6）。

圖6 重組質(zhì)粒 pcDNA3.1－gE、pcDNA3.1－gE’酶切及PCR鑒定結(jié)果

2.5 PCR 鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果 提取 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’轉(zhuǎn)染后的 vero 細(xì)胞總 RNA，并以提取的細(xì)胞總RNA為模板，分別以gE基因的P1／P2、gE’基因的 P11／P22為引物進(jìn)行 RT－PCR 擴(kuò)增，得到了相應(yīng)大小DNA片段（圖7），而以提取的空載體pCDNA3.1轉(zhuǎn)染的 vero細(xì)胞總 RNA為模板RT－PCR擴(kuò)增后則未見(jiàn)相應(yīng)條帶，從轉(zhuǎn)錄水平上說(shuō)明gE和gE’基因均在vero細(xì)胞獲得表達(dá)。

圖7 pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’和 pCDNA3.1轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞RT－PCR結(jié)果

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光鑒定 轉(zhuǎn)染48h后，經(jīng)用熒光顯微鏡觀察，只有重組質(zhì)粒pCDNA3.1－gE’轉(zhuǎn)染的 vero細(xì)胞可見(jiàn)綠色熒光（圖 8 A），而pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1 轉(zhuǎn)染的 vero 細(xì)胞中未見(jiàn)明顯熒光（圖8B，C），結(jié)果表明gE’基因在vero細(xì)胞中獲得了正確表達(dá)，具有免疫原性，能與抗體結(jié)合。

圖8 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞后間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果

3 討論與小結(jié)

本研究結(jié)果表明，鴨腸炎病毒AV1221株 gE基因完整的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)為1473 bp，共編碼490個(gè)氨基酸，其中第1～22位氨基酸為信號(hào)肽序列。其基因序列與國(guó)內(nèi)分離強(qiáng)毒CHv株［9］、國(guó)內(nèi)疫苗株［10］和德國(guó)分離強(qiáng)毒 2085 株［11］均具有較高同源性，說(shuō)明鴨腸炎病毒AV1221株gE比較保守。而軟件TMHMM 2.0預(yù)測(cè)表明gE蛋白是典型的囊膜糖蛋白，包括較長(zhǎng)的胞外區(qū)（396個(gè)氨基酸）、跨膜區(qū)（23個(gè)氨基酸）和胞質(zhì)區(qū)（71個(gè)氨基酸），這與常華［12］結(jié)果一致。

皰疹病毒gE蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)是其功能研究的重要方面，Zhu等［13］將VZV gE構(gòu)建在真核表達(dá)質(zhì)粒pSVK3上，轉(zhuǎn)染COS－7細(xì)胞，用間接免疫熒光方法檢測(cè)到VZV gE蛋白在COS－7細(xì)胞中表達(dá)并定位于COS－7細(xì)胞的高爾基體。常華［12］利用間接免疫熒光方法檢測(cè)到DEV gE蛋白可在感染鴨胚成纖維細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。在本研究中，含信號(hào)肽的表達(dá)載體pCDNA3.1－gE在vero細(xì)胞內(nèi)完成了轉(zhuǎn)錄過(guò)程，但卻未能在vero細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到熒光，與上述研究結(jié)果并不一致，推測(cè)可能與所用毒株、宿主細(xì)胞不同以及存在信號(hào)肽有關(guān)。因此又構(gòu)建了去信號(hào)肽的真核表達(dá)載體pCDNA3.1－gE’，轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞后完成了轉(zhuǎn)錄過(guò)程，并進(jìn)行了表達(dá)，證實(shí)gE自身所具有的信號(hào)肽序列可以有效誘導(dǎo)gE蛋白分泌到細(xì)胞外，與軟件TMHMM 2.0預(yù)測(cè)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)表明，在真核表達(dá)體系中，信號(hào)肽的有無(wú)對(duì)gE蛋白的表達(dá)具有顯著的影響。

本研究通過(guò)酶切和PCR方法證實(shí)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒 pCDNA3.1－gE 和 pCDNA3.1－gE’，并在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上檢測(cè)了pCDNA3.1－gE、pCDNA3.1－gE’在 vero細(xì)胞中的表達(dá)，下一步將通過(guò)G418抗生素篩選穩(wěn)定表達(dá)gE的vero細(xì)胞系，為gE蛋白的體外表達(dá)、功能研究、鴨瘟抗體檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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