邢 剛，邱小伙，阮系真，金玉蘭

(浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310058)

2000年，郎洪武等(2000)［1］曾對(duì)北京、河北、山東、天津、江西等省市不同階段豬群血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PCV2(豬圓環(huán)病毒2 型)抗體陽(yáng)性率高達(dá)42%，表明PCV2 在國(guó)內(nèi)豬群中流行已很普遍;周繼勇等(2004)［2］利用IFA 方法對(duì)浙江省內(nèi)2000－2002年間的2039 份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)浙江省內(nèi)豬群中普遍存在PCV2 感染;隨后的PCV2 流行病學(xué)調(diào)查表明:國(guó)內(nèi)豬群的PCV2 感染已較普遍;不同地區(qū)不同生長(zhǎng)階段豬群的PCV2 抗體陽(yáng)性率變化較大(10%～90%);公豬、母豬及育肥豬的抗體陽(yáng)性率明顯高于仔豬，血清學(xué)調(diào)查及臨床癥狀表明在過(guò)去10年中，PCV2 已給中國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重影響［3］。

ELISA 檢測(cè)技術(shù)由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于豬群病原微生物抗體監(jiān)測(cè)。本研究比較了國(guó)內(nèi)市售兩種PCV2 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果，以期為豬群PCV2 抗體水平監(jiān)測(cè)選擇合適的試劑盒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 PCV2 ZJ/C 株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存，IFA 測(cè)定其TCID50為10－7.0/0.1 mL，PK-15 細(xì)胞Dulac 株由本實(shí)驗(yàn)室保存，MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen 公司(California，USA)，脫脂奶粉購(gòu)自上海某乳業(yè)股份有限公司，新生牛血清購(gòu)自杭州某生物工程材料研究所，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的羊抗豬IgG 購(gòu)自KPL 公司(Maryland，USA)。

ELISA 檢測(cè)試劑盒分別購(gòu)自國(guó)內(nèi)兩家不同研發(fā)公司。分別命名為ZJ-ELISA、HB-ELISA。兩種試劑盒均在有效期內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 IFA 檢測(cè) 對(duì)44 份臨床血清進(jìn)行間接免疫熒光方法(IFA)檢測(cè)。

具體步驟:PCV2 ZJ/C 株按1%比例接入傳代后的PK15 細(xì)胞懸液中，在37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)成單層;棄培養(yǎng)液，細(xì)胞用預(yù)冷的丙酮:甲醇(1∶1)混合液在－20℃下滲透和固定30 min，移去固定液并自然干燥后，每孔加入100 μL 5%脫脂奶，37℃下封閉45 min;棄封閉液，并用PBS洗滌3 次后，加入100 μL 分別用PBS 稀釋100 倍和20 倍的待檢豬血清，37℃下，孵育60 min，用PBS 清洗5 次后加入1 ∶400 倍稀釋的FITC 標(biāo)記羊抗豬IgG，37℃下避光溫育30 min;PBS 洗滌5 次后，吸水紙上拍干，加入100 μL PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

結(jié)果判定，樣品作100 倍稀釋時(shí)有特異性熒光者為陽(yáng)性;樣品在20 倍稀釋時(shí)無(wú)特異熒光者為陰性;樣品在100 倍稀釋時(shí)無(wú)特異熒光者，而在20 倍稀釋時(shí)有特異熒光者為弱陽(yáng)性［4］。

1.2.2 ELISA 檢測(cè)血清 利用兩種試劑盒分別檢測(cè)44 份臨床血清，并判定其結(jié)果。

檢測(cè)方法按試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，具體步驟如下。

ZJ-ELISA 試劑盒檢測(cè)方法:血清利用試劑盒自帶稀釋液稀釋400 倍后，加樣(100 μL/孔)，37℃孵育30 min，洗滌5 次后，加酶標(biāo)二抗，37℃孵育30 min 后再洗滌，加底物液，室溫避光顯色10 min，加終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD值并計(jì)算S/P 值，反應(yīng)設(shè)陽(yáng)性，弱陽(yáng)性，陰性對(duì)照。當(dāng)S/P 值大于等于0.25 時(shí)，樣品為陽(yáng)性;小于等于0.16 時(shí)，則判定為陰性。

HB-ELISA 試劑盒檢測(cè)方法:血清利用試劑盒自帶稀釋液稀釋40 倍后，加樣(100 μL /孔)，37℃孵育30 min 后，洗滌5 次，加酶標(biāo)二抗，37℃孵育30 min，再洗滌，加底物液，室溫避光顯色10 min，加終止液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于630 nm 波長(zhǎng)測(cè)定OD值，反應(yīng)設(shè)陽(yáng)性，陰性對(duì)照。當(dāng)OD 值大于0.42 時(shí)判為陽(yáng)性;小于0.38 時(shí)，則判為陰性。

1.2.3 檢測(cè)數(shù)據(jù)處理

S/P 值計(jì)算公式如下。

S/P 值= (樣本平均值－ 陰性對(duì)照平均值)/(陽(yáng)性對(duì)照平均值－陰性對(duì)照平均值)。

臨界值=陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD 值×0.25。

ELISA 檢測(cè)方法與IFA 檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率、陰性符合率和總符合率計(jì)算公式如下。

陽(yáng)性符合率=兩種方法同時(shí)定性為陽(yáng)性的血清份數(shù)/IFA 總陽(yáng)性數(shù)。

陰性符合率=兩種方法同時(shí)定性為陰性的血清份數(shù)/IFA 總陰性數(shù)。

總符合率=兩種方法同時(shí)定性為為陽(yáng)性或陰性樣本數(shù)之和/檢測(cè)總數(shù)。

配對(duì)卡方檢驗(yàn)及Kappa 檢驗(yàn)(一致性檢驗(yàn))利用SPSS 軟件進(jìn)行［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 符合率比較 詳見(jiàn)表1～表3。

表1 ZJ-ELISA 與IFA 對(duì)44 份臨床血清結(jié)果的比較

表2 HB-ELISA 與IFA 對(duì)44 份臨床血清結(jié)果的比較

表3 HB-ELISA 與ZJ－ELISA 對(duì)44 份臨床血清結(jié)果的比較

由表可見(jiàn)，對(duì)44 份血清檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，IFA 陽(yáng)性檢出率為86.37%(38/44)，陰性檢出率為13.63%(6/44);ZJ-ELISA 檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性檢出率為86.37%(38/44)，陰性檢出率為13.63% (6/44);HB-ELISA 檢測(cè)試劑盒陽(yáng)性檢出率為86.37%(38/44)，陰性檢出率為13.63%(6/44)。

ZJ-ELISA 檢測(cè)試劑盒和HB-ELISA 檢測(cè)試劑盒與IFA 檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率均為92.11%(35/38)，陰性符合率均為50%(3/6)，總符合率均為86.36%(38/44)(表1，表2)。

ZJ-ELISA 檢測(cè)試劑盒和HB-ELISA 檢測(cè)試劑盒間的陽(yáng)性符合率為97.37%(37/38)，陰性符合率為83.33%(5/6)，總符合率均為95.45% (42/44)(表3)。

2.2 配對(duì)卡方檢驗(yàn)及Kappa 檢驗(yàn) 兩種PCV2 抗體檢測(cè)試劑盒與IFA 檢測(cè)結(jié)果間的差異及兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果間的差異利用配對(duì)卡方檢驗(yàn)方法(McNemar test)進(jìn)行檢驗(yàn)。其結(jié)果如下。

ZJ-ELISA 檢測(cè)試劑盒和HB-ELISA 檢測(cè)試劑盒與IFA 檢測(cè)結(jié)果McNemar test 的P 值均為1，大于0.05，表明這幾種方法的檢測(cè)結(jié)果間差異不顯著。ZJ-ELISA 檢測(cè)試劑盒和HB-ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果McNemar test 的P 值同樣為1，大于0.05，表明這兩種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果差異不顯著。

兩種PCV2 抗體檢測(cè)試劑盒與IFA 檢測(cè)結(jié)果的一致性及兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果間的一致性利用Kappa 檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。其結(jié)果如下。

ZJ-ELISA 檢測(cè)試劑盒和HB-ELISA 檢測(cè)試劑盒與IFA 檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果Kappa 值均為0.421，大于0.4，表明ELISA 檢測(cè)方法與IFA 檢測(cè)方法所得檢測(cè)結(jié)果一致性一般。

上述兩種ELISA 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，Kappa 值均為0.807，大于0.75，表明這兩種試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性較好。

3 小結(jié)與討論

PCV2 為目前豬群中廣泛流行的一種病原微生物，給全世界養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［6］。由PCV2 ORF2 編碼的病毒衣殼蛋白(Cap 蛋白)是PCV2 的主要抗原，該蛋白大小為27.8 kDa，具有PCV2 特異性的抗原表位［7］。

有研究認(rèn)為Cap 蛋白與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的發(fā)生有關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查表明PCV2的致病性與Cap 蛋白存在有關(guān)［8］。

目前防治PCV2 感染主要通過(guò)接種疫苗。目前市場(chǎng)所售豬圓環(huán)病毒疫苗主要有勃林格殷格翰公司和先靈葆雅公司基于桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)研制的PCV2 Cap 蛋白亞單位疫苗、法國(guó)梅里亞公司研制的PCV2 全病毒滅活苗、美國(guó)富道公司開(kāi)發(fā)的PCV1/2嵌合病毒滅活疫苗等。

國(guó)產(chǎn)豬圓環(huán)病毒疫苗則有豬圓環(huán)病毒滅活疫苗LG 株，SH 株和ZJ/C 株，這些疫苗接種豬群后能誘導(dǎo)豬體產(chǎn)生針對(duì)PCV2 的中和抗體，且主要針對(duì)Cap蛋白。

臨床檢測(cè)該抗體水平的主要途徑是通過(guò)相關(guān)ELISA 檢測(cè)試劑盒。

本研究比較了國(guó)內(nèi)不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的兩種PCV2 抗體ELISA 檢測(cè)試劑盒。試劑盒均以PCV2 Cap 蛋白作為包被抗原，ELISA 檢測(cè)試劑盒均為間接法。

研究以IFA 檢測(cè)方法首先檢測(cè)了44 份臨床豬血清，并判定其陰陽(yáng)性，然后利用這兩種試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別檢測(cè)了上述44 份血清樣品。

檢測(cè)結(jié)果表明，這兩種試劑盒與IFA 檢測(cè)方法相比，陽(yáng)性檢出率均為86.37%(38/44)，陰性檢出率均為13.63%(6/44)，具有較高的符合率。

配對(duì)卡方檢驗(yàn)及Kappa 檢驗(yàn)表明PCV2 抗體檢測(cè)試劑盒與IFA 檢測(cè)結(jié)果差異不顯著，一致性較好;兩個(gè)試劑盒間的檢測(cè)結(jié)果差異不顯著且一致性非常好，陽(yáng)性符合率為97.37%(37/38)，陰性符合率為83.33%(5/6)，總符合率為95.45%。

綜上所述，國(guó)內(nèi)市售試劑盒能很好用于對(duì)豬群進(jìn)行PCV2 抗體監(jiān)測(cè)。

［1］郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30:3－5.

［2］周繼勇，陳慶新，葉菊秀，等.豬圓環(huán)病毒2 型感染的血清學(xué)分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，24:1－3.

［3］GE X N，WANG F，GUO X，et al.Porcine circovirus type 2 and its associated diseases in China ［J］.Virus Res，2012，164:100－6.

［4］陳慶新，商紹彬，葉菊秀，等.杭州地區(qū)豬II 型圓環(huán)病毒抗體的血清學(xué)調(diào)查［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2003，33:26－28.

［5］唐潔，唐啟義，程家安.病蟲(chóng)發(fā)生程度預(yù)報(bào)質(zhì)量評(píng)估方法［J］.昆蟲(chóng)知識(shí)，2006，43:410－413.

［6］MADSON D M，OPRIESSNIG T.Effect of porcine circovirus type 2 (PCV2) infection on reproduction:disease，vertical transmission，diagnostics and vaccination［J］.Anim Health Res Rev，2011，12:47－65.

［7］MAHE D P，BLANCHARD C，TRUONG C，et al.Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes［J］.J Gen Virol，2000，81:1815－24.

［8］CHO H.S，KIM T J，LEE J I，et al.Park:Serodiagnostic comparison of enzyme-linked immunosorbent assay and surface plasmon resonance for the detection of antibody to porcine circovirus type 2 ［J］.Can J Vet Res，2006，70:263－8.