孟凡旭，吳月紅，金文靜，王春生，許學(xué)偉

（1.國家海洋局 海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310012；2.國家海洋局 第二海洋研究所，浙江 杭州 310012；3.浙江海洋學(xué)院 蕭山校區(qū)基礎(chǔ)部，浙江 杭州 311231）

0 引言

自然環(huán)境中的細菌群落結(jié)構(gòu)研究在微生物生態(tài)學(xué)中具有重要意義［1］。群落結(jié)構(gòu)反映了微生物所處生境的特征，通過群落結(jié)構(gòu)研究，可分析微生物在生態(tài)系統(tǒng)中的功能及其在生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用。

長江口由于受長江徑流影響，鹽度變化較大。長江口及沖淡水區(qū)是不同水團的交匯區(qū)，南部臺灣暖流攜帶的高鹽水沿海洋底部深谷自東南楔入該交匯區(qū)，北部低鹽的黃海水團沿蘇北沿岸到達該區(qū)，長江沖淡水則向東北方向擴展［2］。此外，被長江徑流攜帶進入海洋的大量陸源溶解營養(yǎng)鹽可直接影響河口的初級生產(chǎn)力，間接影響細菌的生長和分布［3－4］。鹽度和營養(yǎng)鹽的復(fù)雜變化，必然對長江口海洋微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生深刻的影響。

對鹽環(huán)境中的微生物而言，鹽份是影響其生長繁殖的非生物主導(dǎo)因子。以微生物的NaCl耐受實驗數(shù)據(jù)為依據(jù)，KUSHNER［5］和 VENTOSA et al［6］把鹽環(huán)境中生存的微生物劃分為不同的生理類型：可在0%（w／v）鹽含量下生長的細菌屬于耐鹽菌，不能在0%wv鹽含量下生長但能在0.5%wv 鹽含量下生長的細菌屬于中度嗜鹽菌。

我國對長江口海洋微生物群落結(jié)構(gòu)研究較少，該海域浮游耐鹽細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的數(shù)據(jù)尤為缺乏［7－9］。本文針對長江口10個站位樣品，分離培養(yǎng)耐鹽細菌并開展系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究，分析了長江口耐鹽細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性，并對這些海洋優(yōu)勢耐鹽細菌類群在海洋環(huán)境中的作用進行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2007年在中國東海（30～32°N，121～127°E）采集了10個站位的表層和底層水（或多管上覆水）共26個樣品（采樣站位見圖1），裝無菌采樣瓶后運抵實驗室4℃保存。

1.2 細菌分離培養(yǎng)

采用高鹽度HM培養(yǎng)基和低鹽度ZMCA培養(yǎng)基分離純化海洋微生物［10］。HM培養(yǎng)基配方：氯化鈉100.0g，氯化鉀2.0g，硫酸鎂（七水）1.0g，氯化鈣（二水）0.36g，溴化鈉0.23g，碳酸氫鈉0.06g，氯化鐵微量，葡萄糖1.0g，peptone（Difco）5g，yeast extract（Difco）10g，PH 7.5。ZMCA培養(yǎng)基配方：氯化鈉19.45g，氯化鎂8.8g，硫酸鈉3.24g，氯化鈣1.8g，氯化鉀0.55g，碳酸氫鈉0.16g，檸檬酸鐵（五水）0.1g，溴化鉀0.08g，氯化銫34mg，硼酸22mg，硅酸鈉4.0mg，氟化鈉2.4mg，硝酸銨1.6mg，磷酸鈉8.0mg，peptone（Difco）0.5g，yeast extract（Difco）0.1g，pH 7.2。

水樣混勻，取80μL涂布于HM 1／10營養(yǎng)（即HM培養(yǎng)基中peptone、yeast extract和葡萄糖取1／10量，其它不變）和ZMCA平板，倒置于培養(yǎng)箱中，28℃光照培養(yǎng)3～5d。每個樣品挑取5個以上（M5－1和M5－4站位每個樣品挑取3個以上）不同形態(tài)特征的菌落，接種于HM液體試管，28℃光照條件下，150r／min搖床震蕩培養(yǎng)至菌液變渾濁，利用三線法平板劃線純化。純化菌株用HM斜面4℃和甘油管－80℃保藏。

1.3 菌株形態(tài)特征觀察

采用活體觀察和透射電鏡觀察2種方式。

活體觀察：取對數(shù)生長期菌液涂于載玻片上，通過光學(xué)顯微鏡（Olympus BX40）觀察細胞運動性及形態(tài)特征。

透射電鏡觀察：取對數(shù)生長期的劃線斜面，刮取菌體懸浮于無菌水中制成菌懸液。將菌懸液滴于銅網(wǎng)上并用濾紙吸去多余液體，然后用醋酸雙氧鈾染色。制作細胞超薄切片時，以2.5%vv戊二醛固定細胞，并通過鋨酸固定、乙醇脫水、包埋、切片和醋酸雙氧鈾染色等步驟制備切片樣品。在透射電鏡（JEM－1230）下觀察細胞的形態(tài)、大小、分裂方式、芽孢產(chǎn)生、細胞壁結(jié)構(gòu)、內(nèi)涵體和鞭毛數(shù)量及形態(tài)等情況。

1.4 耐鹽性實驗

菌液以1%（v／v）接種量接入3mL 0%（w／v）NaCl HM液體試管和0.5% （w／v）NaCl HM 液體試管，置于恒溫搖床28℃震蕩培養(yǎng)，每天觀察生長情況，連續(xù)觀察記錄一周。

1.5 硝酸鹽、亞硝酸鹽還原實驗

菌液以10% （v／v）接種量（300μL）接入0.2%（w／v）KNO3和0.05%（w／v）NaNO2HM 液體試管，培養(yǎng)3～7d，待菌液生長渾濁后進行Griess檢驗。

在比色瓷盤小窩中倒入少許培養(yǎng)液，分別加1滴Griess A液及B液，在不接種對照中也同樣加入A液和B液各一滴。若無色再加入1到2滴二苯胺試劑，溶液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色、棕色等表明亞硝酸鹽存在。加入二苯胺試劑后，不呈藍色反應(yīng)，表明硝酸鹽和形成的亞硝酸鹽都已還原成其他物質(zhì)；加入二苯胺試劑后，呈藍色反應(yīng)，表明培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽。

Griess試劑A液配方為0.5g對氨基苯磺酸和150mL 10%（v／v）稀醋酸。Griess試劑B液配方為0.1gα－萘胺，20mL蒸餾水和150mL 10%（v／v）稀醋酸。二苯胺試劑配方為0.5g二苯胺溶于100mL濃硫酸中，用20mL蒸餾水稀釋。

1.6 分離純化菌株的分子鑒定

采用菌液PCR法擴增純培養(yǎng)物16SrDNA序列，PCR擴增引物為27bf（5'－AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG－3'）和 1 492br（5'－ACG GHT ACC TTG TTA CGA CTT－3'）。

50μL反應(yīng)體系為：5μL 10×PCR Buffer，0.5μL dNTP Mixtures（10mmol／L），1μL Primer 27bf和Primer 1 492br（4μmol／L），41μL H2O，1μL模板DNA，0.5 μL Taq酶（Takara）。PCR反應(yīng)條件為：50μL反應(yīng)體系加入50ng DNA模板，33個循環(huán)：變性94℃，45s；退火55℃，45s；延伸72℃，90s。

PCR擴增產(chǎn)物送北京諾賽基因公司進行純化并進行DNA序列測定，測序引物為27bf，測定的序列長度大于500bp。測定序列采用Blastn進行比對。相似性低于97%的序列，采用27bf和1 492br重新進行測定。重新測定后的序列長度大于1 300bp，為16SrDNA序列長度的90%以上。

1.7 長江口細菌多樣性分析

根據(jù)EzTaxon－e比對和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將獲得的16SrDNA序列進行歸類，定義相似性小于97%的序列作為不同分類單元，采用物種多樣性、豐富度、均勻度和優(yōu)勢度指數(shù)進行多樣性分析。

細菌序列與從數(shù)據(jù)庫（EzTaxon－e）中獲得的相近序列，應(yīng)用Mega 5.05進行多序列匹配比對，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并通過自展分析進行置信度檢測，自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)境特征

長江口、杭州灣及沖淡水區(qū)是一個不同水團的交匯區(qū)，由近岸向外海，由灣頂向灣口，鹽度逐漸增高，全水域變幅為0.03～34.5。長江口、杭州灣及其口門附近海域為鹽度最低區(qū)域，M5－1、N6－2和 M4－1三個站位處于該區(qū)域，鹽度小于20（圖1a）。硝酸鹽濃度在灣頂最高，達到125.88μmol／L（圖1b）。

圖1 采樣站位鹽度（a）和硝酸鹽含量（b）Fig.1 Salinity（a）and nitrate concentration（b）of sampling stations

圖2 菌株L039細胞形態(tài)圖Fig.2 Cell morphology of strain L039

2.2 長江口細菌的分離及分子鑒定

根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等特征，挑取分離平板上的單菌落進行四分劃線純化，分別通過HM培養(yǎng)基和ZMCA培養(yǎng)基從長江口水樣中分離得到136株菌和20株菌。以L039菌株為例，菌落無色，圓形，略微凸起，直徑為1～2mm，顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)細菌具有單極鞭毛（圖2）。

采用細菌通用引物，擴增獲取了156株菌株的16S rDNA序列。分子鑒定結(jié)果表明，以HM培養(yǎng)基分離的136株菌株可劃分至33個不同的分類單元（OTU），這些菌株分別屬于α－變形菌綱（Alphaproteobacteria，7株， 5.15%γ－變形菌綱（Gammaproteobacteria86株，63.2%）和厚壁菌門中的芽孢桿菌綱（Bacilli，43株，31.6%）3個類群（表1和圖3）。α－變形菌綱分屬于海棲菌屬（Oceanicola）、箭頭菌屬（Sagittula）、橙色單胞菌屬（Aurantimonas）和斯塔普氏菌屬（Stappia）；γ－變形菌綱分屬于交替單胞菌屬（Alteromonas）、海桿菌屬（Marinobacter）和假交替單胞菌屬（Pseudoalteromonas）；芽孢桿菌綱分屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、薄壁芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）、海洋芽胞桿菌屬（Oceanobacillus）、鹽芽孢桿菌屬（Halobacillus）和深海芽孢桿菌屬（Thalassobacillus）。以ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的20株菌株分屬α－變形菌綱（Alphaproteobacteria，16株，80%）和放線菌綱（Actinobacteria4株，20% 兩個類群，可劃分為10個不同的分類單元。

圖3 HM培養(yǎng)基分離細菌在各站位類群分布Fig.3 Distribution of bacteria isolated from medium HM within different stations

表1 長江口細菌類群數(shù)量及多樣性指數(shù)Tab.1 Number of cultured marine bacteria and diversity indices in the Changjiang River Estuary

圖4 長江口可培養(yǎng)耐鹽變形菌門細菌16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 16SrDNA sequences of Proteobacteria strains from the seawater in the Changjiang River Estuary

α－變形菌綱細菌對環(huán)境依賴程度較大，多數(shù)為嚴(yán)格好養(yǎng)微生物，一旦面臨惡劣環(huán)境容易發(fā)生不可逆損傷而不能增殖。在高鹽條件下分離獲得的α－變形菌綱細菌數(shù)量少，隸屬于4個屬。γ－變形菌綱的細菌適應(yīng)性較強，能利用多種碳源物質(zhì)進行生長［11］，它們在不同環(huán)境的生態(tài)系統(tǒng)中都有廣泛的分布［12］。其中，交替單胞菌屬廣泛分布于海水中，且在開放海域及海岸均有分布，該類群好氧、化能異養(yǎng)，能利用短鏈脂肪酸和一些烷烴作為唯一碳源；海桿菌屬多數(shù)為兼性好養(yǎng)菌，其生存范圍較為寬廣［13］，是海水中可培養(yǎng)的優(yōu)勢細菌；假交替單胞菌屬據(jù)報道具有殺藻的能力［14－15］。厚壁菌門細菌生存范圍較為寬廣，具有很好的環(huán)境適應(yīng)性。從靠近海岸的站點（M5－1、N6－2和M4－1）分離得到的細菌均為厚壁菌門（Firmicutes）微生物，而遠離海岸的站點細菌均屬于變形菌門（圖3），可見靠近海岸的站點和遠離海岸的站點細菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，這與 M5－1，N6－2和 M4－1三個站位受到長江口和杭州灣淡水的影響鹽度變化較大，同時受長江口外長期缺氧及陸源污染物的影響有關(guān)，也表明厚壁菌門細菌對這種特殊的環(huán)境具有更好的適應(yīng)性。

圖5 長江口可培養(yǎng)耐鹽厚壁菌門細菌16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16SrDNA sequences of Firmicutes strains from the seawater in the Changjiang River Estuary

分離所得變形菌門和厚壁菌門微生物及其相鄰菌株系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4和圖5所示，圖中標(biāo)尺為每個核苷酸置換率為0.02，置信度小于60的未標(biāo)出數(shù)值。分離所得大多數(shù)菌株與已報道的分離自海洋或其他環(huán)境的微生物相似性很高（＞97%），但研究也發(fā)現(xiàn)一些菌株與已報道標(biāo)準(zhǔn)菌株間的相似度較低。如L039與Pseudoalteromonasbyunsanensis的相似性為97%，可能代表了新的分類單元。

2.3 長江口細菌多樣性分析

物種多樣性是把物種的數(shù)目和個體數(shù)目分配狀況（豐度和均勻度）結(jié)合起來考慮的一個統(tǒng)計量，它反映了生物群落和生態(tài)系統(tǒng)的特征，例如結(jié)構(gòu)類型、發(fā)展階段、穩(wěn)定程度和生境差異等等。Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)是對稀有物種敏感的指數(shù)；與之相反，Shannon均勻度指數(shù)和Berger－Parker優(yōu)勢度指數(shù)屬于對富集種相對敏感的指數(shù)。

從分離結(jié)果來看，長江口細菌具有較好的物種多樣性（表1），且其中一些菌株與已報道菌株16SrDNA序列間差異較大，說明我國長江口水域有許多未被發(fā)現(xiàn)的微生物資源。由于培養(yǎng)基對微生物的選擇性及培養(yǎng)條件的局限性，分離的菌株集中于變形菌門等少數(shù)門類，大量難培養(yǎng)微生物的分離尚有待于探索。HM培養(yǎng)基為模擬海產(chǎn)品腌制的高鹽度培養(yǎng)基，ZMCA培養(yǎng)基為模擬海洋環(huán)境的低鹽度培養(yǎng)基，以這2種培養(yǎng)基分離的菌株多樣性指數(shù)略有差異但不明顯（表1）。HM培養(yǎng)基分離得到的細菌多樣性較ZMCA培養(yǎng)基差，與HM培養(yǎng)基鹽度較高，對微生物篩選作用較強有關(guān)；ZMCA培養(yǎng)基是一種寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，相比其他普通培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基降低了營養(yǎng)成分濃度，可在很大程度上避免少數(shù)菌株生長過快導(dǎo)致多樣性偏低的現(xiàn)象。

2.4 長江口細菌耐鹽性、硝酸鹽還原性和亞硝酸鹽還原性分析

通過HM培養(yǎng)基分離培養(yǎng)獲得的136株菌株中，有70.5%的菌株可在0%（w／v）NaCl條件下生長，屬于耐鹽菌；25.9%菌株不能在0%（w／v）NaCl條件下生長但能在0.5%（w／v）NaCl條件下生長，屬于中度嗜鹽菌；另外3.59%菌株不能在小于0.5%（w／v）NaCl條件下生長，生長的下限未知，能耐受10%（w／v）的NaCl，也屬于中度嗜鹽菌。通過ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的菌株均可在0%（w／v）NaCl條件下生長，屬于耐鹽菌。

通過分離結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)與陸地不同距離的站位其微生物類群有很大不同。長江口受淡水流入影響，鹽度變化較大，該系統(tǒng)中的微生物部分來自海洋，另一部分則來自陸地并適應(yīng)了海洋環(huán)境，鹽濃度適應(yīng)也是其表現(xiàn)之一。

對分離自HM培養(yǎng)基的136株細菌的硝酸鹽和亞硝酸鹽還原性分析表明，30.3%的細菌能還原硝酸鹽，而只有9.90%的細菌能還原亞硝酸鹽，其數(shù)量僅為硝酸鹽還原細菌的1／3左右。

3 結(jié)論

本研究采用HM培養(yǎng)基和ZMCA培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)得到長江口10個站位樣品的耐（嗜）鹽菌156株，分析分離得到的菌株可知：

（1）以HM培養(yǎng)基分離獲得136株菌株，可劃分為33個分類單元，分屬于α－變形菌綱、γ－變形菌綱和厚壁菌門中的芽孢桿菌綱3個類群，其中γ－變形菌綱為優(yōu)勢耐（嗜）鹽細菌。與陸地不同距離的站位其微生物類群有很大不同：靠近海岸的站點 M5－1，N6－2和 M4－1耐（嗜）鹽細菌均屬于厚壁菌門，而遠離海岸的站點耐（嗜）鹽細菌均屬于變形菌門。由HM培養(yǎng)基分離獲得的菌株中，耐鹽菌占70.5%，中度嗜鹽菌占29.5%。

（2）以ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的20株菌株分屬α－變形菌綱（80%）和放線菌綱（20%），可劃分為10個分類單元。由ZMCA培養(yǎng)基分離獲得的菌株均為耐鹽菌。

（3）HM培養(yǎng)基分離得到的136株細菌的硝酸鹽和亞硝酸鹽還原性分析表明，亞硝酸鹽還原菌數(shù)量僅為硝酸鹽還原菌的1／3左右。這表明在海產(chǎn)品腌制過程中，亞硝酸鹽的產(chǎn)生速度可能遠遠高于其轉(zhuǎn)化為N2或N2O的速度，由于亞硝酸鹽具有毒性，在腌制海產(chǎn)品這種高鹽的閉合環(huán)境中，亞硝酸鹽的積累過程和轉(zhuǎn)化效率是關(guān)系到食品安全的重要問題，應(yīng)引起足夠的重視。

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