王小巧　 朱芮　 李瓊潔等

摘要 [目的]探索預處理和培養(yǎng)基類型對小孢子離體培養(yǎng)的影響。[方法]以洋桔梗為材料進行小孢子培養(yǎng)，研究預處理和培養(yǎng)基類型對小孢子離體培養(yǎng)的影響，并篩選胚性愈傷組織適宜誘導培養(yǎng)基、不定芽植株培養(yǎng)基以及最佳生根培養(yǎng)基。[結果]利用4 ℃低溫預處理 24 h 有利于小孢子愈傷組織的形成。愈傷組織適宜誘導培養(yǎng)基為：MS+3 mg/L KT+ 2.5 mg/L 2，4-D；不定芽植株培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA；最佳生根培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA +1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭。經(jīng)過染色體倍性鑒定，顯示小孢子培養(yǎng)后染色體數(shù)目減半。[結論]該方法研究了預處理和培養(yǎng)基類型對小孢子離體培養(yǎng)的影響，為洋桔梗游離小孢子培養(yǎng)體系的建立以及單倍體育種奠定基礎。

關鍵詞 洋桔梗（Eustoma grandiflorum）；小孢子；離體培養(yǎng)；愈傷組織

中圖分類號 S682.3 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）08-02291-04

Preliminary Study on Microspore Culture of Eustoma grandiflorum

WANG Xiaoqiao， HE Fengmei et al （College of Horticulture and Landscape， Yunnan Agricultural University， Kunming， Yunnan 650201）

Abstract [Objective] To explore effects of pretreatment and culture medium types on microspore in vitro culture. [Method] With Eustoma grandiflorum as material， effects of pretreatment and culture medium types on microspore culture were studied. The appropriate induction culture medium， adventitious bud plant culture medium and optimum rooting culture medium for callus were obtained. [Result] The result showed that treating microspore 4℃ for 24 hours benefited the growing of callus. Solidliquid medium containing MS+3mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D was conducive to callus induction， medium containing MS+1 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L Sucrose+6.1 g/L Agar was beneficial to adventitious buds induction， suitable medium for root growth contained MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5mg/L IBA+30 g/L Sucrose +6.1 g/L Agar+0.3 g/L Active carbon. Result of the chromosome ploidy identification showed that the chromosome numbers were halved through microspore culture. [Conclusion] The effects of pretreatment and culture

medium types on microspore in vitro culture were studied， which will lay a foundation for establishment of Eustoma grandiflorum microspore culture system and haploid breeding.

Key words Eustoma grandiflorum； Microspore； Culture in vitro； Callus

洋桔梗（Eustoma grandiflorum）又名草原龍膽，為龍膽科草原龍膽屬（Eustoma）植物，瓶插期長、耐長途運輸，花姿雅麗，花形別致，花色豐富，具有較高的觀賞價值，是世界上十分流行的高檔切花之一[1]。我國各地也競相引種栽培，極具市場開發(fā)前景。但其種源主要是從國外進口F1代雜種，價格昂貴[2]。洋桔梗是異花授粉植物，容易授粉，種子量多，自交存在衰退現(xiàn)象，自交系之間雜交（F1）表現(xiàn)出超強雜種優(yōu)勢。由于國外引進洋桔梗品種復雜的遺傳背景，使其F1代雜交種子后代分離嚴重，不能留種種植，因此，傳統(tǒng)的洋桔梗花卉育種常采用雜交一代（F1）育種程序進行。在雜種優(yōu)勢利用中，親本必須是純合的，經(jīng)組配后才能得到性狀一致具有強雜種優(yōu)勢的雜交種。洋桔梗常規(guī)的育種方法選育自交系，獲得一個純系需要6～8年，時間期限長，選擇效率低，耗費大量的人力和物力，再加之洋桔梗為異花授粉，存在自交衰退現(xiàn)象，從而導致洋桔梗自交系的獲得較困難[3]。

通常由小孢子培養(yǎng)來獲得純合材料僅需要1～2年時間，大大縮短自交系選育年限，加速育種進程，提高育種效率，是現(xiàn)代植物育種中快速、高效的育種途徑之一[4-5]。國內(nèi)外已有利用小孢子培養(yǎng)獲得植物自交系的報導[6-8]，但關于洋桔梗小孢子培養(yǎng)獲得單倍體自交系的研究鮮有報道。筆者開展洋桔梗小孢子培養(yǎng)技術研究，以期為解決我國洋桔梗雜交種子生產(chǎn)問題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象。供試洋桔梗材料，來自玉溪市通?？h瑞園園藝有限公司，經(jīng)鑒定為龍膽科草原龍膽屬（Eustoma）植物洋桔梗（Eustoma grandiflorum）。

1.1.2 主要試劑。所用試劑均為遇分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1 小孢子的分離純化。采集田間健壯植株上的花蕾，在4 ℃的冰箱中放置1～2 d，進行抗寒鍛煉。取出后用洗滌液清洗外表面并用流動水沖洗 5 min，在超凈工作臺上用濃度75%乙醇處理30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡 10～15 min，無菌水洗滌3次，每次5 min。瀝干水分后，在B5培養(yǎng)基中用玻璃棒碾壓花蕾，擠出小孢子。小孢子懸浮液經(jīng)孔徑300目的尼龍網(wǎng)1 000 r/min下離心3次，時間分別為15、10和5 min，棄上清液，加入MS培養(yǎng)液混合，用移液器取3.0 ml混合液于MS固體培養(yǎng)基中，25 ℃下暗培養(yǎng)1周，轉至光照培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織誘導芽分化的培養(yǎng)。將在光照下培養(yǎng)長出的愈傷組織轉接至含有不同濃度6BA和NAA的MS培養(yǎng)基上進行固體培養(yǎng)，誘導芽分化。溫度25 ℃，光照2 000 lx，pH值5.8～6.0。

1.2.3 生根培養(yǎng)。將上述長出的小苗，轉入含有6BA、NAA和IBA的MS生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。采用5組處理，處理1：MS+0.2 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA+0.3 g/L活性炭；處理2：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；處理3：MS+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；處理4：MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭；處理5：MS+0.5 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭，2周后進行生根統(tǒng)計。

1.2.4 小孢子再生植株倍性鑒定。取田間生長的“ceremony orange”植株和小孢子再生植株根尖1.0～1.5 cm放入0.002 mol/L的8羥基喹啉中固定24 h，用無菌水沖洗3次，放入卡諾氏溶液中（無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，V/V）2 h，無菌水沖洗干凈后，在1 mol/L的HCl中浸泡5～10 min，無菌水沖洗3次，制片，卡寶品紅染色，顯微鏡下檢測染色體數(shù)目變化。

2 結果與分析

2.1 不同因素對小孢子胚性愈傷組織誘導率的影響

2.1.1 花蕾大小對小孢子胚性愈傷組織誘導率的影響。小孢子的發(fā)育時期是影響小孢子培養(yǎng)的關鍵因素之一，選擇合適的花粉發(fā)育時期可極大地提高植株小孢子胚性愈傷組織發(fā)生的誘導頻率。圖1表明，隨著花蕾的長度的增加，胚性愈傷組織誘導率增加，當花蕾大小在2.0～2.5 cm時，胚性愈傷組織誘導率達到最大；當花蕾長度超過3 cm時，胚性愈傷組織誘導率降低。因此，當花蕾大小2.1～2.5 cm時，胚性愈傷組織誘導率高，達到76%。對花蕾的小孢子進行檢測，證實此時期正是小孢子單核靠邊期。

圖1 花蕾大小對小孢子胚性愈傷組織誘導率的影響

2.1.2 低溫預處理對小孢子愈傷組織誘導率的影響。低溫預處理是小孢子培養(yǎng)的一個關鍵，適宜的低溫和處理時間可改善小孢子代謝活動，有利于小孢子適應離體后的培養(yǎng)環(huán)境，促使小孢子正常生長。圖3表明，不同的低溫處理對小孢子愈傷組織誘導有一定作用，當溫度處于4 ℃，愈傷組織誘導率最高。隨著處理時間的增加，愈傷組織誘導率增加，當處理時間達到24 h時，愈傷組織誘導率達到最大，隨著時間的再增加，誘導率降低。因此，最佳的預處理時間和溫度分別為24 h和4 ℃。

圖2 低溫預處理對小孢子愈傷組織誘導率的影響

2.1.3 不同水平的生長調(diào)節(jié)劑激素對小孢子愈傷組織誘導率的影響。培養(yǎng)基成分對小孢子胚的誘導和形成影響極大，其中蔗糖濃度、不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及添加有機營養(yǎng)成分至關重要。每個配方重復5次。由表1和圖3可知，培養(yǎng)20 d后，MS+3.0 mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D誘導的胚性愈傷組織最多，其誘導率達75%。MS+2.0 mg/L KT+2.5 mg/L 2.4D誘導的胚性愈傷組織最少，其誘導率為28%。

2.2 芽誘導及生根培養(yǎng)

2.2.1 不同水平的植物生長調(diào)節(jié)劑對誘導芽的影響。采用不同水平的植物生長調(diào)節(jié)劑誘導愈傷組織出芽，每個處理設5次重復，每個重復接種4個胚性愈傷組織，共20個愈傷組織。由表2可知，MS+1.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA誘導芽的效率最好，達到85%。MS+2.0 mg/L 6BA+0.2 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 6BA+0.5 mg/L NAA均未出苗。

圖4 愈傷組織誘導芽分化

2.2.2 不同水平的植物生長調(diào)節(jié)劑對植株生根的影響。采用5個不同處理，觀察不同水平的植物生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響。結果表明：不添加IBA或者6BA生根率都很低；當6BA的濃度超過0.2 mg/L IBA或濃度低于1.5 mg/L植株的生根率都不佳。因此，6BA濃度過高、IBA濃度過低都影響洋桔梗生根率。選擇合適的濃度是植株生根的關鍵。誘導植株生根的最佳配方為：MS+0.2 mg/L 6BA+1.0 mg/L NAA+1.5 mg/L IBA+0.3 g/L活性炭生根率最佳，可達到80%以上。

2.3 染色體數(shù)目的比較 對小孢子培育植株及田間四倍體植株進行染色體數(shù)目檢測[9]，共檢測10棵植株，30條根，觀察60個細胞。發(fā)現(xiàn)小孢子培育植株根尖染色體數(shù)均為36條，田間四倍體植株根尖染色體數(shù)為72條。由此說明，試驗進行的小孢子組織培養(yǎng)苗是二倍體。

3 結論與討論

通過花藥和小孢子離體培養(yǎng)技術開展植物單倍體育種工作是現(xiàn)代生物技術育種最有效的手段之一，但在植物花藥組織培養(yǎng)中，很多情況下獲得的再生植株中并沒有單倍體植株的存在，花藥培養(yǎng)獲得的再生植株絕大部分是來自于花藥壁的二倍體細胞，也有可能少量來自單倍性的花粉粒。因此，單倍體出現(xiàn)的頻率很低，甚至沒有，因而，不能形成足夠的選擇群體，同時也導致再生植株混雜（混倍），要從這樣的混雜植株中再挑選出單倍體植株費工費時。從培養(yǎng)過程來看，花藥離體培養(yǎng)相對較容易，技術比較成熟，而小孢子離體培養(yǎng)盡管不受花藥壁、藥隔等二倍體細胞的干擾，但這種特殊單倍體細胞的培養(yǎng)技術難度較大，目前只在少數(shù)植物上獲得成功[10]。

小孢子培養(yǎng)技術是一種高效、安全的育種新途徑，能快速地從大量群體中獲得新的種資源。并且有力地縮短了雜交育種的年限。另一方面該技術的應用可以為植物的新種質(zhì)的創(chuàng)建和新品種的快速選育提供新的思路、途徑和方法[11]。

花蕾中小孢子發(fā)育的一致性對胚狀體或愈傷組織的再生有很大影響。不同品種單核靠邊期的花蕾發(fā)育時期是不一樣的，同一品種生長環(huán)境不一致，其單核靠邊期的花蕾發(fā)育時期也不一致。試驗通過萊卡顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)，采集的洋桔?！癱eremony orange”花蕾在2.0～2.5 cm時處在單核靠邊期，處在該時期的花蕾胚性愈傷組織誘導率高達到76%；再生植株誘導率100%。與其他小孢子培養(yǎng)不同的是胚性愈傷組織誘導并非采用NLN13液體培養(yǎng)基，而是采用MS固液培養(yǎng)，一方面胚性愈傷組織誘導率相對液體培養(yǎng)提高很多，另一方面可以大大降低污染率。組織培養(yǎng)過程中愈傷組織易出現(xiàn)褐化以及活力不足，但在培養(yǎng)基中加入0.1 g/L的活性炭并且及時的更換新鮮培養(yǎng)基可以有效的減輕褐化現(xiàn)象。對于再生植株根尖染色體的鑒定，根尖在9點前取要比在其他時間取得根尖效果好，能夠較清楚的看清染色體的條數(shù)。隨著小孢子培養(yǎng)條件的不斷改善 和培養(yǎng)技術的進一步改進。小孢子培養(yǎng)技術和單倍體育種手段將在草原龍膽屬作物的育種領域中發(fā)揮出更大的作用。

參考文獻

[1]

李昀輝.草原龍膽生物學特性及遺傳研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2004.

[2] 陸繼亮.云南洋桔梗切花生產(chǎn)技術關鍵[J].中國花卉園藝，2011（6）：28.

[3] 丁兵，王江.草原龍膽種苗繁育及優(yōu)質(zhì)切花生產(chǎn)技術[J].種子世界，2006（9）：42.

[4] LICHTER R.Induction of haploid plant from isolated polen of Bras-sica napus [J].ZP Flanzenhysiol，1982，105：427-434.

[5] SATO T，NISHIO T，HIRAIM M.Plant regeneration from isolation microspore of Chinese cabbage （Brassica campestris sp.Pekinensis）[J].Plant Cell Rep，1989，8：486488.

[6] 曹鳴慶，李巖，蔣濤，等.大白菜和小白菜游離小孢子培養(yǎng)試驗簡報[J].華北農(nóng)學報，1992，7（2）：119-120.

[7] 王建紅，馮慧，王茂良，等.植物游離小孢子培養(yǎng)技術研究進展[J].北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院學報，2009，23（2）：32-36.

[8] 李枸，官舂云，陳社元，等.油菜小孢子培養(yǎng)和雙單倍體育種研究[J].作物學報，2003，29（5）：744-749.

[9] LINDSAY G C，HOPPING M E，BRIEN I E.Detection of protoplast-derived DNA tetraploid Lisianthus （Eustoma grandiflorum）plants by leaf and flower characteristics and by flow cytometry [J].Plant Cell Tissue and Organ Culture，1994，38：53-55.

[10] WEDZONY M，F(xiàn)ORSTER B P，ZUR I，et al.Progress in doubled haploid technology in higher plants[M]//TOURAEV A，F(xiàn)ORSTER B P，JAIN S M.Advances in haploid production in higher plants.NY：Springer Science，Business Media，2009：1-33 .

[11] FORSTER B，HEBERLEBORS E，KASHA K，et al.The resurgence of haploids in higher plants [J].Trends in Plant Science，2007，12（8）：368-375.