丁俊男　遲德富

摘要 [目的]考察鹽脅迫對(duì)桑葉中1脫氧野尻酶素含量的影響。[方法]以黑龍江省桑樹品種青龍桑為試驗(yàn)材料，采用不同鹽濃度下對(duì)桑苗進(jìn)行鹽脅迫處理，利用高效液相色譜測定1脫氧野尻酶素的含量。[結(jié)果]不同濃度的NaCl脅迫下桑樹葉片的1脫氧野尻酶素含量均高于對(duì)照，其中50 mmol/L NaCl溶液處理下桑樹葉片中1脫氧野尻酶素含量在第31天達(dá)到最大值，為1.51 mg/g；并且，在NaCl脅迫下桑樹上部葉的1脫氧野尻酶素含量大于下部葉。[結(jié)論]適當(dāng)?shù)柠}濃度能有效提高桑苗葉片中1脫氧野尻酶素的含量。

關(guān)鍵詞 桑樹（Morus alba L.）；鹽脅迫；1脫氧野尻酶素；含量測定；高效液相色譜

中圖分類號(hào) S888.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）08-02315-03

Effects of Salt Stress on 1DNJ Content in Mulberry Leaf

DING Junnan， CHI Defu

（College of Life Science， Northeast Forest University， Harbin， Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To investigate effects of salt stress on 1DNJ content in mulberry leaf. [Method] With Heilongjiang mulberry variety Qinglongsang as test material， different concentration salt stress treatments were conducted. HPLC method was used to determine 1DNJ content. [Result] The results showed that the DNJ contests of mulberry is higher than CK under the salt stress， and 50 mmol/L NaCl mulberry leaf in solution with DNJ contents reach maximum 1.51 mg/g after 31 days. Under NaCl stress， 1DNJ content in upper leaves of mulberry is higher than that of the lower leaves. [Conclusion] The appropriate salt concentration can effectively improve 1DNJ content in mulberry leaf.

Key words Mulberry； Salt stress； 1 Deoxynojirimycin； Content determination； High performance liquid chromatography

桑屬植物桑（Morus alba L.）作為傳統(tǒng)中藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，在我國已有數(shù)千年的栽培歷史，根皮、枝葉、果實(shí)等皆可入藥，具有重要的藥用價(jià)值[1]，特別是近年來桑樹中1脫氧野尻霉素（1deoxynojirimycin，DNJ）的研究引起國內(nèi)外注意。其化學(xué)結(jié)構(gòu)與α1，4葡萄糖類似，具有降血糖的作用，在糖尿病、肥胖癥和病毒感染等疾病方面顯示出明顯藥理作用[2]。DNJ是植物的次生代謝產(chǎn)物，是植物對(duì)環(huán)境適應(yīng)而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，也是植物防御逆境災(zāi)害的防御機(jī)制之一，在調(diào)節(jié)植物與生態(tài)環(huán)境的關(guān)系中起一定作用。很多植物次生代謝物都有治療疾病的功能，也是醫(yī)藥產(chǎn)品和化學(xué)產(chǎn)品的來源[3-7]。許多藥用植物在受到外界刺激后，能夠明顯提高甚至合成很多藥用次生代謝產(chǎn)物，并且這些藥用物質(zhì)還會(huì)有化學(xué)防御作用的物質(zhì)，通常稱之為植保素（phytoalexin）。DNJ在干旱、鹽堿和低溫等逆境條件下能有效的積累。對(duì)于植物體本身而言，DNJ的積累主要用于自身對(duì)逆境的防御，還可用于藥物的開發(fā)。目前，有關(guān)桑樹不同種類、不同品種、同一品種的不同器官和不同生長季節(jié)的DNJ含量測定和變化已有很多研究[8-11]，如：施氮量和氮素形態(tài)[12]、光照[13]等對(duì)桑樹葉片中DNJ含量均有影響。鹽脅迫是限制植物生長發(fā)育的重要因素[14-15]，特別是目前我國北方地區(qū)桑樹的推廣主要集中在鹽堿化程度較高的廢棄用地，但目前有關(guān)鹽脅迫對(duì)桑樹葉片中DNJ含量的影響方面的研究鮮有報(bào)道。為此，筆者探討不同濃度NaCl脅迫對(duì)桑樹葉片中DNJ含量的影響，以期為提高桑樹DNJ的含量及藥用價(jià)值提供理論依據(jù)，并為指導(dǎo)藥用桑樹的合理推廣栽培提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對(duì)象。供試桑樹（Morus abla L.），品種為2年實(shí)生桑苗“青龍?！?，由黑龍江省蠶業(yè)研究所提供。

1.1.2

主要儀器。Agilent 1100型高效液相色譜儀，購自Agilent公司。

1.1.3

主要試劑。DNJ標(biāo)準(zhǔn)品和芴甲氧基酰氯（FMOCCl），購自Sigma公司；乙腈和甘氨酸為色譜純，購自天津基準(zhǔn)試劑有限公司；其余試劑均為分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

色譜條件。色譜柱為C18柱（Hypersil GOLD）；流動(dòng)相為乙腈-醋酸（55∶45，V/V）；流速為1.0 ml/min；柱溫25 ℃；紫外檢測器激發(fā)波長為254 nm。

1.2.2

樣品的初處理。試驗(yàn)于2013年7月在東北林業(yè)大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2013年5月選取長勢一致的桑苗種于35 cm×40 cm的培養(yǎng)缽中，每缽定植一株。選擇長勢相對(duì)一致的30株苗作為試驗(yàn)用苗，于2013年7月1日開始控水5 d，第6天進(jìn)行鹽脅迫處理，各處理分別澆灌濃度為50、100、150、200和250 mmol/L的NaCl溶液，以正常澆水處理為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)5株重復(fù)。每個(gè)培養(yǎng)缽下放置塑料托盤以防止鹽分流失，每隔2 d澆鹽溶液1次，每次澆灌1 000 ml。每次澆灌前采集桑樹上部葉（1～5葉位）及下部葉（6～10葉位），采收的葉片立即殺青（105 ℃，30 min）后烘干（80 ℃，30 h）至恒質(zhì)量，烘干的樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3

樣品的提取。各取不同鹽處理桑葉粉0.200 g于2 ml離心管中，加入0.05 mol/L HCl溶液1.0 ml，渦旋混合2 min ，超聲波處理40 min，于12 000 r/min離心30 min，收集上清液，沉淀物再按上步重新提取一次，合并2次上清液，定容至2 ml，即得樣品提取液。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4

對(duì)照品溶液的制備。精密秤取5.0 mg DNJ標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，加入500 ml濃度0.05 mol/L HCl溶液，搖勻即得DNJ標(biāo)準(zhǔn)母液；用蒸餾水將母液配制成1、10、20、30、40、50和60 μg/ml系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5

方法學(xué)考察。（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。取適量對(duì)照品溶液和樣品溶液，按照“1.2.1”中色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。（2）線性關(guān)系的考察。取制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照“1.2.1”中色譜條件進(jìn)樣，以DNJ濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性回歸方程。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。將桑樹葉片的待測液放置于溫室條件下，進(jìn)行衍生化處理之后，分別于0、1、2、4、6、8、12、14和16 h 測定峰面積，利用DNJ標(biāo)準(zhǔn)品濃度和色譜峰面積之間的擬合方程，計(jì)算DNJ含量的RSD。（4）重現(xiàn)性試驗(yàn)。精密稱取桑葉樣品6份，衍生化處理后，進(jìn)行HPLCUV測定，計(jì)算DNJ含量及RSD。（5）加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量DNJ的桑樹樣品5份，加入DNJ標(biāo)準(zhǔn)品，衍生化處理后，經(jīng)HPLCUV測定，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。

1.2.6

衍生化處理。取100 μl待測樣品提取液于2 ml離心管中，加入200 μl pH 8.5的0.4 mol/L硼酸鉀緩沖液，然后加入250 μl濃度5 mmol/L的FMOCCl（溶于50%的乙腈中）溶液，渦旋混合，于25 ℃恒溫水浴箱中反應(yīng)20 min，加入1 mol/L甘氨酸50 μl中和剩余的衍生化試劑FMOCCl，再加入50 μl體積分?jǐn)?shù)為1%的醋酸溶液，用水定容至刻度；最后用0.45 μm針頭過濾器過濾，即可進(jìn)行HPLCUV檢測。標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生化步驟同上。取10 μl進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

（1）系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，在DNJ標(biāo)準(zhǔn)樣的色譜圖中含有3個(gè)吸收主峰，峰1為DNJFOMC，峰2為GLYFMOC，峰3為FMOCOH。待測樣品中DNJ與相鄰組分之間得到了較好的基線分離。在DNJ衍生化處理中，加入試劑芴甲氧基酰氯（FMOC）后的水解副產(chǎn)物FMOCOH和GLYFMOC均不干擾分析組分的測定。（2）線性關(guān)系的考察。以DNJ標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（X）和色譜峰面積（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性擬合，得到DNJ濃度與色譜峰面積之間的線形回歸方程為：Y=265.17X17.53，R=0.994 6。試驗(yàn)結(jié)果表明，在1～60 μg/ml范圍內(nèi)，DNJ濃度與色譜峰面積的線性關(guān)系良好。（3）穩(wěn)定性試驗(yàn)。計(jì)算得DNJ含量的RSD為4.01%，表明待測液DNJ在16 h之內(nèi)基本穩(wěn)定。（4）重現(xiàn)性試驗(yàn)。計(jì)算得DNJ的平均含量為0.861，RSD為2.5%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。（5）加樣回收率試驗(yàn)。由表1可知，平均加樣回收率為90.9%，RSD為2.3%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于桑葉中1脫氧野尻酶素的含量測定。

2.2 鹽脅迫對(duì)桑樹DNJ含量的測定

圖2表明，對(duì)照組桑樹葉片中的DNJ含量始終維持在0.6～0.8 mg/g，不同濃度鹽脅迫下桑樹葉片中的DNJ含量均明顯高于對(duì)照。在濃度50 mmol/L的NaCl脅迫下，桑樹葉片中的DNJ含量積累表現(xiàn)明顯，并且在31 d時(shí)達(dá)到最大值1.51 mg/g，平均含量為1.11 mg/g。濃度100、150、200和250 mmol/L的NaCl脅迫下桑樹葉片中的DNJ含量表現(xiàn)出相同的變化規(guī)律，均在處理第21天時(shí)達(dá)到峰值，分別為1.48、1.29、1.20和1.09 mg/g，并且隨著NaCl濃度的增加，桑樹葉片中DNJ含量的峰會(huì)逐漸降低，脅迫處理21 d后隨著脅迫時(shí)間的延長，各處理桑樹葉片中DNJ含量均呈降低趨勢。

2.3 鹽脅迫下桑樹上部葉與下部葉DNJ含量的測定

圖3表明，在整個(gè)試驗(yàn)過程中各濃度鹽處理的桑葉取上部葉和下部葉進(jìn)行DNJ含量的測定，結(jié)果表明桑樹上部葉DNJ含量均大于下部葉含量，其整體DNJ含量變化呈現(xiàn)從升高到降低的趨勢，上部葉與下部葉的平均含量分別為0.88和0.75 mg/g。

3 結(jié)論與討論

植物對(duì)任何環(huán)境的適應(yīng)都會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生一些形態(tài)剖析，物候與生理上的變化[16-17]。適宜的鹽度不僅能促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長，而且能促進(jìn)植物的營養(yǎng)生長，而且能促進(jìn)某些鹽生植物的開花與果實(shí)發(fā)育。鹽脅迫幾乎影響植物所有的重要生命過程，如生長、光照、蛋白合成、能量和脂類代謝[18]。通過試驗(yàn)可知，鹽脅迫下桑樹葉片中1脫氧野尻霉素（1DNJ）均有不同程度的增加，在鹽濃度不斷積累的情況下呈現(xiàn)出先上升在下降的趨勢，并且其總平均含量大于對(duì)照。試驗(yàn)還對(duì)桑樹上部葉與下部葉DNJ含量進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果表明上部葉DNJ含量大于下部葉含量，有研究表明桑樹上部嫰葉DNJ含量大于下部成熟葉是一種化學(xué)防御機(jī)制。根據(jù)C/N平衡的假設(shè)（CNB）可推斷出植物在貧瘠的土地上，形成次生代謝產(chǎn)物是一種防御機(jī)制。由此可見，適當(dāng)?shù)柠}濃度對(duì)桑樹DNJ含量的積累有積極作用，DNJ作為一種次生代謝產(chǎn)物，桑樹葉片中的DNJ含量在鹽脅迫下的大量積累可能具有一些其他的生理功能，有待更進(jìn)一步的研究。生物堿作為一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有明顯生理生物活性，當(dāng)外部生態(tài)環(huán)境改變和動(dòng)物取食時(shí)，生物堿可作為一種植物保護(hù)劑。在試驗(yàn)過程中，鹽脅迫使土壤中的水勢下降，造成桑苗的水分虧缺的生理干旱狀態(tài)影響生長，當(dāng)試驗(yàn)進(jìn)行19～21 d時(shí)，各試驗(yàn)組的桑苗均出現(xiàn)桑葉變黃，葉片脫落，桑苗對(duì)100～250 mmol/L的NaCl高度敏感。

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