摘要

[目的] 為進(jìn)一步拓展新型重組中性植酸酶的工業(yè)應(yīng)用。[方法] 研究海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖等糖類及不同的金屬離子對其穩(wěn)定性的影響。[結(jié)果] 該突變植酸酶的穩(wěn)定性強(qiáng)烈依賴Ca2+的存在。當(dāng)CaCl2濃度為0.10 mol/L，90 °C加熱10 min時，剩余活性約為原來的67.7%。同時，添加糖類對酶穩(wěn)定性也起到較好的保護(hù)作用。當(dāng)80 、85、90 °C受熱10 min時，海藻糖呈現(xiàn)出最好的保護(hù)性能，加入0.8 mol/L 左右，可使剩余酶活分別是原來的84.3%、65.5%和48.3%，為未添加時的2.61、4.34和15.00倍。 此外，在80 ℃加熱條件下，麥芽糖也表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用，剩余活性是未添加時的2.51倍。但是，在更高溫度下尤其是90 ℃時，植酸酶的活性幾乎完全喪失。[結(jié)論] 該研究結(jié)果可為植酸酶在水產(chǎn)飼料加工中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞中性植酸酶；穩(wěn)定性；添加劑

中圖分類號S188+.3；Q814文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2014）06-01607-03

Abstract[Objective] The research aimed to further expand the industrial application of the new neutral phytase. [Method] The effects of trehalose maltose， sucrose， glucose and different metal ions on its stability were studied. [Result] The stability of the phytase strongly depended on the presence of Ca2+. The remained activity was about 67.7% of the original under the condition of CaCl2 0.10 mol/L and 90 ℃ heating for 10 min. Adding sugars to the phytase also played a significant role in the improvement of the stability. Trehalose presented the best protection by adding 0.8 mol/L trehalose at 80 ℃， 85 ℃ and 90 ℃ heating for 10 min. The remained activities were about 84.3%， 65.5% and 48.3% of the original， and were 2.61， 4.34 and 15.00 times of the nonadditive phytase， respectively. Maltose also showed pretty good protective role at 80 ℃. The remained activity was 2.51 time of nonadditive phytase. However， maltose lost protection role at higher temperatures of 90 ℃， and the phytase activity almost completely lost. [Conclusion]The study provided important information for further application of phytase in aquatic feed processing.

Key wordsNeutral phytase； Stability； Additive

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸酶（Myoinositol hexaphoshate phosphohydrotase），是催化植酸及其植酸鹽水解產(chǎn)生肌醇和磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱[1]。它是一種新型、綠色、環(huán)保的飼料用酶，對于提高飼料中磷的利用率、提高機(jī)體對蛋白質(zhì)及多種微量元素的利用率及減輕因動物高磷糞便所導(dǎo)致的環(huán)境污染有著極其重要的意義[2]。目前，有關(guān)植酸酶的研究主要集中在酸性植酸酶上，但它不適用于消化道為中性的淡水鯉科魚類和畜禽消化道中呈中性的部位[3-4]。中性植酸酶主要來源于芽孢桿菌，其酶促反應(yīng)的pH有效作用范圍在7.0～7.5之間，可以有效彌補(bǔ)酸性植酸酶的不足[5-9]。然而，中性植酸酶在應(yīng)用過程中還存在一些問題，其中最突出的就是該酶在高溫制粒殺菌工藝中活力損失較大，因此獲得高熱穩(wěn)定性的中性植酸酶成為近年來的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。如何提高酶蛋白分子在液體狀態(tài)下的穩(wěn)定性是開發(fā)液體劑型成功的關(guān)鍵。有研究表明，糖類、多羥基醇類等與酶蛋白分子表面的-NH3、-OH或-COOH等基團(tuán)相互作用，可以有效提高酶分子的穩(wěn)定性[10-11]。當(dāng)酶活性中心含有離子作為配位體時，鹽類作為液體酶的添加劑也可以通過離子鍵起到穩(wěn)定酶構(gòu)象的作用[12-13]。

筆者前期已經(jīng)從淀粉液化芽孢桿菌中克隆到新型中性植酸酶基因，構(gòu)建了高效表達(dá)的重組菌[14-15]，并且運(yùn)用基因工程的技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突點(diǎn)，獲得突變酶活性顯著增加，并已申請中國發(fā)明專利[16]。關(guān)于中性植酸酶的基因工程菌的構(gòu)建及改造的研究也一直受到國內(nèi)外科研人員的關(guān)注，已成功獲得幾種中性植酸酶的基因工程菌[17-21]。目前，對于化學(xué)添加劑對中性植酸酶熱穩(wěn)定性影響的研究還不夠深入，其液體劑型的開發(fā)方面還處于起步階段。為進(jìn)一步拓展新型重組中性植酸酶的工業(yè)應(yīng)用，筆者在前期獲得的重組酶的基礎(chǔ)上，研究糖類及不同的金屬離子對新型重組中性植酸酶穩(wěn)定性的影響，為高穩(wěn)定中性植酸酶液體制劑的開發(fā)及工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

海藻糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、氯化鎂、氯化鈣、鉬酸銨、三羥甲基氨基甲烷、偏釩酸銨、乙酸鈉等，均為國產(chǎn)分析純。植酸鈉購于Sigma公司，蛋白純化試劑盒購于康為世紀(jì)公司。重組中性植酸酶為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2方法

1.2.1重組中性植酸酶的純化。

構(gòu)建好的重組大腸桿菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，離心，收集菌體，超聲破碎后取上清液。采用康為世紀(jì)NiAgarose 6xHis標(biāo)簽蛋白純化，試劑盒在4 ℃下進(jìn)行純化，并透析[15]。

1.2.2中性植酸酶活性的測定。

2.1無保護(hù)劑時中性植酸酶的熱穩(wěn)定性

選取適量濃度的純化的突變植酸酶，分別在75、80、85和90 ℃受熱10 min，以未受熱酶活為100%，測定其剩余酶活。由圖1可知，酶受熱溫度越高，剩余酶活越低。在75、 80、85、90 ℃，中性植酸酶分別剩余78.3%、32.3%、15.1%和3.2%的活性。高溫制粒和高溫消毒是現(xiàn)代飼料工業(yè)中常見的加工工藝。從無添加劑的液體酶來看，在75 ℃下加熱10 min，酶活性損失20%左右，溫度升高到80 ℃以上時絕大部分中性植酸酶變性，活性損失達(dá)60%以上。因此，為了更好地發(fā)揮植酸酶的作用，通過添加一定的穩(wěn)定劑對酶進(jìn)行保護(hù)具有非常重要的意義。2.2糖類添加劑對重組中性植酸酶熱穩(wěn)定性的影響

2.2.1在75 ℃熱處理?xiàng)l件下，添加不同糖類對酶熱穩(wěn)定性的影響。

由圖2可知，添加不同糖類的中性植酸酶溶液在75 ℃受熱10 min后，酶活性總體保持在初始活性的70%以上。在此條件下，葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、海藻糖的最適添加濃度為0.2 mol/L，植酸酶活性分別為初始活性的120.2%、1032%、99.0%和91.1%。剩余活性分別是未添加穩(wěn)定劑植酸酶的1.54、1.32、1.26 和1.16倍。 從圖2還可以看出，當(dāng)葡萄糖和蔗糖的添加量超過0.2 mol/L時，植酸酶剩余活性急劇下降。與其他糖類相比，以海藻糖為穩(wěn)定劑，在測試的濃度范圍內(nèi)均表現(xiàn)出較穩(wěn)定的保護(hù)酶活性的效果。2.2.2在80 ℃熱處理?xiàng)l件下，添加不同糖類對酶熱穩(wěn)定性的影響。

由圖3可知，添加不同糖類的中性植酸酶溶液在80 ℃受熱10 min后，酶活性總體保持在初始活性的50%以上。在此條件下，各種糖類對中性植酸酶的保護(hù)作用由大到小依次為海藻糖>麥芽糖>蔗糖>葡萄糖。在添加濃度為0.7～0.9 mol/L時，海藻糖、麥芽糖及蔗糖對酶活的保護(hù)作用隨濃度的變化不明顯，剩余酶活基本保持穩(wěn)定。其中，海藻糖的最適濃度為0.8 mol/L，在此條件下植酸酶剩余活性達(dá)到最高，為84.3%。麥芽糖最適濃度為0.7 mol/L，植酸酶剩余活性為81.2%；蔗糖和葡萄糖最適濃度為09 mol/L，植酸酶剩余活性分別為71.5%和60.4%。在最適濃度下，添加穩(wěn)定劑海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖后，剩余活性分別是未添加時的2.61、2.51、2.21和1.87倍。

2.2.3在85 ℃熱處理?xiàng)l件下，添加不同糖類對酶熱穩(wěn)定性的影響。

由圖4可知，添加不同糖類的中性植酸酶溶液在85 ℃條件下受熱10 min后，各種糖類對中性植酸酶的保護(hù)作用大小順序?yàn)楹Ｔ逄?蔗糖>葡萄糖>麥芽糖。 與80 ℃條件相比，海藻糖仍起到最好的保護(hù)作用，在最適濃度0.8 mol/L下中性植酸酶剩余活性最高，為65.5%。然而，麥芽糖的保護(hù)作用明顯降低，蔗糖與麥芽糖在最適濃度0.8 mol/L時，剩余活性分別為54.0%和45.3%。而葡萄糖的最適濃度為09 mol/L，剩余活性為51%。在最適濃度下，添加穩(wěn)定劑海藻糖、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖后，剩余活性分別是未添加時的434、3.58、3.38和3.0倍。

2.2.4在90 ℃熱處理?xiàng)l件下，添加不同糖類對酶熱穩(wěn)定性的影響。

由圖5可知，添加不同糖類的中性植酸酶溶液在90 ℃受熱10 min后，即使添加穩(wěn)定劑，中性植酸酶的剩余活性也在50%以下。在添加濃度超過0.8 mol/L的條件下，各種糖類對中性植酸酶的保護(hù)作用大小順序?yàn)楹Ｔ逄?葡萄糖>蔗糖>麥芽糖。海藻糖的保護(hù)作用仍然明顯，1.0 mol/L海藻糖能使中性植酸酶的剩余酶活達(dá)到48.3%。葡萄糖的最適濃度為0.9 mol/L，剩余活性為45.0%；蔗糖的最適濃度為0.8 mol/L，剩余活性為45.6%。當(dāng)受熱溫度上升到90 ℃時，添加麥芽糖基本上沒有保護(hù)作用，植酸酶幾乎失去全部活性。在最適濃度下，添加穩(wěn)定劑海藻糖、葡萄糖、蔗糖后，剩余活性分別是未添加時15.10、14.06和14.25倍。

42卷6期路國偉等化學(xué)添加劑對新型重組中性植酸酶穩(wěn)定性的影響

酶熱穩(wěn)定性的影響。研究表明，該突變植酸酶的穩(wěn)定性強(qiáng)烈依賴Ca2+的存在。當(dāng)CaCl2濃度為0.10 mol/L，90 ℃加熱的條件下，剩余活性約為原來的67.7%。與未添加熱穩(wěn)定劑的植酸酶相比，添加糖類等對酶的穩(wěn)定性起到較大幅度的改善作用。這是因?yàn)樵谥菜崦革暳霞庸?yīng)用過程中，溫度是一個重要參數(shù)。因此，研究過程中對不同溫度下加入各種糖類的情況進(jìn)行比較。在80、85、90 ℃受熱條件下，海藻糖呈現(xiàn)出保護(hù)性能最好，加入0.8 mol/L 左右時可使剩余酶活分別為原來的84.3%、65.5%和48.3%；在75、80 ℃受熱條件下，麥芽糖表現(xiàn)出較好的保護(hù)作用，但在更高溫度下尤其是在90 ℃條件下麥芽糖失去保護(hù)作用，植酸酶活性幾乎完全喪失。該研究結(jié)果為植酸酶的制劑開發(fā)及其在水產(chǎn)飼料加工中的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

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