摘要

[目的]為了探討試驗(yàn)用和臨床用紫杉醇對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用的差異。[方法]用不同濃度的試驗(yàn)用和臨床用紫杉醇處理肝癌HepG2培養(yǎng)細(xì)胞后，通過(guò)顯微觀察和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其細(xì)胞凋亡。[結(jié)果]臨床用紫杉醇在終濃度為0.5、1.0和2.0 mg/ml時(shí)，24 h非常顯著性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，48 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更劇烈。試驗(yàn)用紫杉醇24 h在終濃度為2.5、5.0和10.0 mg/ml時(shí)，非常顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；當(dāng)試驗(yàn)用紫杉醇濃度為2.5 mg/ml時(shí)，48 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更劇烈。當(dāng)試驗(yàn)用紫杉醇濃度為5和10 mg/ml細(xì)胞凋亡率逐步變低，可能走向死亡。[結(jié)論]在誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡中，試驗(yàn)用紫杉醇要比臨床所用紫杉醇的濃度要高。

關(guān)鍵詞紫杉醇；肝癌細(xì)胞HepG2 ；細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞術(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)S857.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）06-01711-03

Abstract[Objective] In order to explore the difference of experimental or clinically used paclitaxel in inducing hepatoma HepG2 cell apoptosis. [Method] The cells were cultured in PRMI1640 medium and treated with experimental or clinically used paclitaxel in the different concentrations. The apoptosis in the cells was detected with the light microscope and the flow cytometry. [Result] With the treatment of the clinical used paclitaxel in the final concentration of 0.5， 1.0， 2.0 mg/ml， the apoptosis can be induced very significantly in 24 hours， the cell apoptosis induced by 48 hours more intense. With experimental paclitaxel for 24 hours at a final concentration of 2.5， 5.0， 10.0 mg/ml， the apoptosis can be induced very significantly in 24 hours； 2.5 mg/ml， apoptosis induced more intense by 48 hours. With the experimental paclitaxel concentration is 5.0， 10.0 mg/ml， the rate of cell apoptosis gradually becomes low， the cells may lead to death. [Conclusion] The concentration of experimental paclitaxel is higher than the clinically used paclitaxel in inducing hepatoma cell apoptosis.

Key words Paclitaxel； Human hepotoma cell line HepG； Apoptosis； Flow cytometry

紫杉醇是一種天然的抗癌新藥，從紅杉屬植物紫杉的樹(shù)皮和樹(shù)干中提取，具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制，可以阻抑細(xì)胞周期于G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[1]。 但是，試驗(yàn)用和臨床用紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的差異鮮有報(bào)道。為此，筆者對(duì)試驗(yàn)用和臨床用紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡進(jìn)行了比較研究。

1材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)、藥物及處理

肝癌細(xì)胞系HepG2由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，用含10%小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基接種細(xì)胞，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后，換成含0.5、1.0、2.0 mg/ml終濃度臨床用紫杉醇的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h。試驗(yàn)用紫杉醇的濃度由低到高直到出現(xiàn)明顯凋亡現(xiàn)象。臨床用紫杉醇注射液（Paclitaxel injection），批號(hào)為12121111，主要成分為紫杉醇。輔料為純化聚氧乙烯基蓖麻油35、無(wú)水乙醇，均由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)用紫杉醇（Paclitaxel），批號(hào)為A0177 （DMSO溶解后以細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至適宜濃度供實(shí)驗(yàn)用）。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.2 凋亡細(xì)胞的檢測(cè)

1.2.1

顯微觀察。光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行顯微照相，觀察產(chǎn)生凋亡細(xì)胞的情況。

3討論

傳統(tǒng)上，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察可以檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。流式細(xì)胞術(shù)作為一種高新技術(shù)，為細(xì)胞凋亡研究提供了有效的技術(shù)手段。該技術(shù)可針對(duì)細(xì)胞在凋亡時(shí)產(chǎn)生的一系列形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)性質(zhì)的變化，胞質(zhì)Ca2+濃度升高，DNA片段化及含量變化等特點(diǎn)，進(jìn)行定性、定量分析，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞凋亡的準(zhǔn)確測(cè)定[1]。紫杉醇（Paclitaxel）是來(lái)源于紅豆杉屬植物的一種二萜類(lèi)化合物，是20世紀(jì)發(fā)現(xiàn)的一種高效廣譜癌癥化療藥物[2]。它是一種高效微管蛋白抑制劑，與先前發(fā)現(xiàn)的微管抑制劑作用靶點(diǎn)和機(jī)制均不同，作用于微管蛋白β亞基N端第31 位氨基酸，促進(jìn)微管聚合并穩(wěn)定微管結(jié)構(gòu)，阻止其解聚成亞單位，進(jìn)而影響微管聚合與解聚的動(dòng)態(tài)平衡，阻礙紡錘絲的形成，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻斷于G2/M期，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡，同時(shí)還可以改變細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。但由于紫杉醇的水溶性很差，只能溶于聚氧乙烯蓖麻油或乙醇等有機(jī)溶劑中。因此，最廣泛的臨床制劑為紫杉醇注射劑，現(xiàn)臨床應(yīng)用的紫杉醇注射液為由聚氧乙烯蓖麻油，無(wú)水乙醇（體積比為50∶50）制成的無(wú)色黏稠狀濃溶液[3-6]。微管是真核細(xì)胞的一種組成部分，其功能是構(gòu)成細(xì)胞的網(wǎng)狀支架，維持細(xì)胞形態(tài)，參與細(xì)胞的收縮偽足運(yùn)動(dòng)，參加細(xì)胞器的位移及胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)?，其中尤為重要的染色體的分裂和位移需要在微管的幫助下進(jìn)行。正常情況下。微管和微管蛋白二聚體之間存在動(dòng)態(tài)平穩(wěn)。微管在鈣離子的作用下解聚。有絲分裂時(shí)形成紡綞體和紡綞絲。牽引染色體向兩極移動(dòng)[7]。紫杉醇依賴(lài)性地、可逆地結(jié)合在微管下，誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白的聚合，穩(wěn)定微管、防止解聚。導(dǎo)致染色體斷裂并抑制細(xì)胞復(fù)制和移行，而阻礙腫瘤細(xì)胞復(fù)制。高濃度及低濃度紫杉醇抑制細(xì)胞有絲分裂和增生的作用機(jī)制并不完全相同， 在高濃度（血清濃度0.45 μmol/L）下增加微管二聚體的數(shù)量和聚合速度， 促進(jìn)微管束的形成； 在低濃度（<10 nmol/L）下抑制胞質(zhì)微管的解聚， 增加其動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。臨床應(yīng)用的主要是紫杉醇注射液， 即由乳浮EL （Cremophor EL， 含聚氧乙烯蓖麻油）/無(wú)水乙醇（50∶50）制成的無(wú)色黏稠狀濃溶液， 使用時(shí)用5%右旋糖酐或生理鹽水稀釋成0.3～1.2 g/L溶液后靜脈滴注3～24 h，輸注劑量為135～ 175 mg/ml，最大耐受劑量（MTD） 為3 h內(nèi)輸注225～ 240 mg/ml[8]。

筆者通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)以含0.5、10和20 mg/ml臨床用紫杉醇的培養(yǎng)基處理肝癌細(xì)胞HepG2，24 h后見(jiàn)到細(xì)胞形態(tài)非常明顯變化的發(fā)生，許多細(xì)胞變圓，細(xì)胞質(zhì)和染色質(zhì)濃縮，細(xì)胞膜彎曲，呈小泡狀；細(xì)胞核碎裂形成典型的凋亡小體。紫杉醇處理肝癌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步增多，正常細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞脫落而懸浮于培養(yǎng)基中；少數(shù)細(xì)胞體積增大、膜破裂而呈細(xì)胞壞死狀。試驗(yàn)用紫杉醇的濃度十幾到幾十倍濃度時(shí)，細(xì)胞才能出現(xiàn)以上狀況。這可能是由于試驗(yàn)用的紫杉醇沒(méi)有充分溶解所致。臨床用紫杉醇中含有助溶劑使其充分溶解，其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用得以充分發(fā)揮。筆者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，臨床用紫杉醇在終濃度為0.5、10和20 mg/ml時(shí)，24 h就可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。試驗(yàn)用紫杉醇在24 h終濃度為2.5、50、100 mg/ml時(shí)，才可非常顯著地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。48 h，試驗(yàn)用紫杉醇在終濃度為25 mg/ml時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡更劇烈，凋亡細(xì)胞比率更高；當(dāng)試驗(yàn)用紫杉醇終濃度為5 mg/ml細(xì)胞凋亡率變低，但和對(duì)照相比較仍有顯著性差異 ；10 mg/ml細(xì)胞凋亡率更低，并且與對(duì)照沒(méi)有顯著性差異。這說(shuō)明試驗(yàn)用紫杉醇需要高濃度時(shí)才能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是，隨著濃度的增高和時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸變少，可能更多細(xì)胞走向死亡的結(jié)果。

為了解決紫杉醇的溶解性等問(wèn)題，更好地進(jìn)行臨床用藥，已經(jīng)開(kāi)展了許多研究。有人利用聚乳酸聚乙醇酸共聚物（Poly lactide—co—glycolic acid，PLGA）納米粒作為紫杉醇的載體，力求發(fā)現(xiàn)一種簡(jiǎn)單高效的新型紫杉醇載藥體，他們研制載紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒，載紫杉醇聚乳酸聚乙醇酸共聚物納米粒子可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且有明顯的量效和時(shí)效關(guān)系，質(zhì)量濃度越高、時(shí)間越長(zhǎng)效果越明顯[2]。利用納米技術(shù)可使紫杉醇與白蛋白納米粒子結(jié)合，除了可以減輕有機(jī)溶劑對(duì)腎和神經(jīng)組織的毒性即降低有機(jī)溶劑所致超敏反應(yīng)發(fā)生率外，白蛋白受體還可以提高藥物向腫瘤細(xì)胞的靶向輸送[3]。解決這個(gè)問(wèn)題主要有2種途徑[4]：①在其化學(xué)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾，增加其水溶性。由于紫杉醇極微小的結(jié)構(gòu)變化都會(huì)對(duì)其與微管蛋白的結(jié)合活性有較大影響，因而修飾時(shí)必須慎重。②采用脂質(zhì)體劑型，以脂質(zhì)體為載體，將紫杉醇包封于其中，使水不溶性的紫杉醇易溶于生理鹽水或5%葡萄糖注射液。這不僅便于臨床用藥，更重要的是避免了因使用Cremophor EL而引起的過(guò)敏反應(yīng)。脂質(zhì)體屬于超微粒藥物載體，具有淋巴系統(tǒng)定性，可以通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入溶酶體，然后被酶消化而放出藥物也可以通過(guò)細(xì)胞融合作用，即脂質(zhì)體膜材料與細(xì)胞膜構(gòu)成物相似，而融合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被消化后釋放藥物，使藥物在靶區(qū)組織中維持較高濃度，以提高抗癌藥物的生物利用度。最近Tatebe等發(fā)現(xiàn)紫杉醇能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡 ；KavalIaris等報(bào)道紫杉醇抑制卵巢上皮腫瘤與改變特定 β—tubulin基因的表達(dá)有關(guān)；Vater等通過(guò)電鏡和掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)任Ca2+和紫杉醇存在下，微管蛋白的聚合發(fā)生畸變而且這種畸變結(jié)構(gòu)隨著加入紫杉醇和Ca2+的順序不同而有所不同。改善其水溶性的最常用方法是制備其衍生物：側(cè)鏈C-2位羥基酯化在體外試驗(yàn)活性較差。體內(nèi)試驗(yàn)表明對(duì)活性影響不大，說(shuō)明酯化產(chǎn)物在體內(nèi)水解成羥基，封閉該位使活性喪失，因此C-2 的酯化是尋找前藥的有效途徑。修飾原則為：功能基在活化條件下應(yīng)能自行從結(jié)合物下脫落，產(chǎn)生紫杉醇；新引入的基團(tuán)能增加該化合物的水溶性[7]。紫杉醇藥物釋放支架和白蛋白納米粒注射液相繼被FDA 批準(zhǔn)上市，是紫杉醇制劑研究的成功例證。國(guó)內(nèi)外尚有乳劑、納米粒、脂質(zhì)體和聚合膠束（Genexol）等制劑進(jìn)入臨床試驗(yàn)，有希望成為下一代臨床藥物。紫杉醇未來(lái)制劑的研發(fā)重點(diǎn)將集中在紫杉醇局部或靶向緩控釋制劑。同時(shí)由于制劑技術(shù)的改進(jìn)，紫杉醇口服給藥將獲得突破[8]。

42卷6期單長(zhǎng)民等試驗(yàn)用和臨床用紫杉醇誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的比較

近期有人開(kāi)發(fā)了一種攜帶紫杉醇（PTX）的膠束，由簡(jiǎn)單的共軛于聚乙二醇5000配方（PEG5K）和恩貝酸（EB）而成。恩貝酸是一種天然產(chǎn)物，通過(guò)阻斷活性X連鎖凋亡蛋白抑制劑（XIAP）具有抗腫瘤活性。PEG5K-EB2共軛自組裝形成穩(wěn)定的在水溶液中的膠束并有效封裝疏水性藥物紫杉醇。體外細(xì)胞攝取研究表明PEG5K-EB2膠束被腫瘤細(xì)胞有效吸收。體外釋放研究表明PTX存在于PEG5K-EB2膠束中。PTX慢慢釋放超過(guò)5 d，比紫杉醇制劑的釋放慢得多。在幾個(gè)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系中形成PEG5K-EB2膠束的 PTX比單獨(dú)紫杉醇形式表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。近紅外熒光（NIRF）成像整體上PEG5K-EB2膠束有選擇性地富集在主要器官的腫瘤部位，包括肝臟和脾。PEG5K-EB2膠束中PTX表現(xiàn)出良好的安全性與最大耐受劑量，20～100 mg PTX/kg的小鼠，顯著高于紫杉醇（15～20 mg PTX/kg）。最后，與在乳腺癌和前列腺癌的小鼠模型中的紫杉醇相比，制成的PEG5K-EB2膠束的PTX表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤活性[9]。

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