陳歡

摘要：目的：探討垂體腫瘤轉化基因（PTTG）和C-myc在妊娠滋養(yǎng)細胞疾?。℅TD）發(fā)生發(fā)展中的作用。方法：收集株洲市中心醫(yī)院收治的GTD病例共55例，同時收集株洲市中心醫(yī)院正常早孕行人工流產的絨毛標本21例作為對照。并應用免疫組化SP法檢測21例正常的早孕絨毛、15例完全性葡萄胎、10例部分性葡萄胎、14例侵蝕性葡萄胎與15例絨癌石蠟包埋組織中PTTG和C-myc的蛋白表達情況。結果：PTTG和C-myc蛋白在細胞滋養(yǎng)層細胞和合體滋養(yǎng)細胞都表達，兩者在正常早孕絨毛與GTD中主要表達于細胞漿，偶表達于細胞核。正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨癌中PTTG蛋白的陽性表達率分別為14.3％、24.0％、78.6％、80.0％；C-myc蛋白的陽性表達率分別為23.5％、30.0％、71.4％、73.3％。PTTG和C－myc在正常早孕絨毛和葡萄胎中的表達量差異無顯著性意義（P＞0.05）；侵蝕性葡萄胎和絨癌的表達量明顯高于正常早孕絨毛和葡萄胎（P＜0.05)；絨癌的表達量高于侵蝕性葡萄胎，但差異無顯著意義（P＞0.05）。在GTD中，PTTG和C-myc的蛋白表達呈正相關（R＝0.724, F=49.663,P＜0.05 )。

結論PTTG和C-myc的表達上調可能是滋養(yǎng)細胞惡性轉化的早期事件，并在GTD的惡化進展中起重要作用。

關鍵詞：妊娠滋養(yǎng)細胞疾??；PTTG；C-myc；免疫組織化學

【中圖分類號】R737.3 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602(2014)05-0016-02

葡萄胎發(fā)病率在世界不同地區(qū)變化很大，亞洲國家比歐洲或北美高3～10倍，葡萄胎是包括我國在內的東南亞國家常見病之一，我國葡萄胎平均發(fā)病率為290/10萬 [1]，其中10～20％在清宮后惡變?yōu)榍治g性葡萄胎或絨癌，早期即可經血液途徑轉移至肺﹑腦等處，嚴重危害婦女的健康。葡萄胎惡變的機制仍不十分清楚，近年來發(fā)現PTTG基因的表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

據已有的報道，關于PTTG基因在腫瘤形成中的作用研究集中在卵巢癌，垂體瘤中，而在滋養(yǎng)細胞腫瘤中的作用機制研究很少。本研究通過SP免疫組化的技術對正常妊娠絨毛組織和GTD中的PTTG及C-myc蛋白的表達情況進行檢測，比較兩者的表達水平，從而探討PTTG與C-myc在GTD的發(fā)生發(fā)展中的作用及可能的作用機制作初步探討。

1 資料和方法

1.1 組織來源：

正常早孕絨毛組（Normal chorionic villi of first trimester,N）:選取株洲市中心醫(yī)院婦產科門診2013年12月至2014年2月正常早孕行人工流產的絨毛標本21例，年齡21～38歲，平均（27±4）歲，均無異常妊娠史。取上述正常早孕行人工流產的絨毛標本，石蠟包埋，作HE染色和免疫組化實驗用。

GTD組： 收集株洲市中心醫(yī)院病理科存檔GTD石蠟包埋標本共55例，其中部分性葡萄胎10例，年齡20～43歲，平均（31±7）歲；完全性葡萄胎15例，年齡22～47歲，平均（29±8）歲；侵蝕性葡萄胎14例，年齡31～49歲，平均（43±6）歲；絨毛膜癌15例，年齡29～54歲，平均（43±9）歲。

1.2 方法免疫組化檢測PTTG和C-myc蛋白的表達：

(1)HE染色

全部收集的標本均經4％中性甲醛液固定，梯度脫水、浸蠟和包埋。所取蠟塊行5μm連續(xù)切片、烘烤、脫蠟、HE染色、透明和封片。

(2) 采用SP法進行免疫組化檢測，具體步驟如下：

① 石蠟切片，厚5μm，用經多聚賴氨酸處理的載玻片撈片，置烤箱60℃，60分鐘。

② 切片脫蠟至水：二甲苯浸泡30分鐘×2次；100％乙醇浸泡30分鐘×2次，95％、85％、75％乙醇依次浸泡各10分鐘；蒸餾水浸泡5分鐘×3次。

③ 抗原修復處理：按不同的抗體要求進行抗原修復。以0.01M，pH6.0檸檬酸高壓或微波爐修復。室溫冷卻后，蒸餾水浸泡5分鐘×3次，繼以0.01M PBS浸洗5分鐘×3次。

④ 滴加A液（3％過氧化氫溶液）25μl，室溫避光孵育30分鐘，以滅活內源性過氧化氫酶活性；0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑤ 滴加B液（封閉用正常山羊血清工作液）25μl，室溫孵育30分鐘。

⑥ 甩去山羊血清，滴加鼠抗人第一抗體25μl，4℃孵育過夜，0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑦ 滴加C液（生物素化二抗工作液）25μl，室溫孵育30分鐘，0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑧ 滴加D液（辣根酶標記鏈霉卵白素工作液）25μl，室溫孵育30分鐘，0.01M PBS沖洗5分鐘×3次。甩去多余液體。

⑨ 滴加新鮮配置的DAB溶液顯色1～2分鐘（顯微鏡下控制顯色時間）。

⑩ 自來水沖洗，蘇木素復染2分鐘，0.05％鹽酸乙醇分化，自來水沖洗反藍15分鐘，梯度乙醇脫水（100％、95％、85％、75％乙醇浸泡各1分鐘），60℃干烤20分鐘，中性樹膠封片。

1.3 結果判斷：

每批免疫組化均設有已知陽性和用PBS代替一抗的陰性對照。PTTG和C-myc均以細胞漿或細胞核內出現明確的棕黃色顆粒為陽性細胞。觀察至少10個具代表性高倍視野，對免疫組化結果進行評估。分別對染色強度（0：無著色；1：淡黃色；2：棕黃色；3:棕褐色）和陽性細胞百分數（0：<5％；1：5％～25％；2：26％～50％；3：51％～75％；4：>75%）進行計分，兩者相加為免疫組化評分，0分～2分為（－），3分～4分為（＋），5分～6分為（＋＋），7分為（＋＋＋）。

1.4 統(tǒng)計學處理：

實驗數據采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。免疫組化實驗結果應用等級資料的秩和檢驗對相關組間進行顯著性檢驗；采用Chi-square test分析法對GTD與PTTG和C-myc的蛋白表達的關系進行相關性分析；結果均以P<0.05為差異有顯著意義，P<0.01為差異有極顯著意義。

2 結果

2．1 PTTG的蛋白表達

2. 1. 1 PTTG蛋白免疫組化定位：

PTTG蛋白的在細胞滋養(yǎng)層細胞和在合體滋養(yǎng)層細胞中都有陽性表達。在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌組織，PTTG蛋白的表達以細胞漿為主，偶爾表達于細胞核，未見細胞膜表達。

2．1．2 PTTG蛋白表達半定量分析：

PTTG蛋白在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌的陽性表達率分別為14.3%、24.0%、78.6%、80.0%。葡萄胎和正常早孕絨毛相比較，PTTG蛋白的表達量的差異無顯著意義（P＞0.05）,侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌的表達量明顯高于正常早孕絨毛和葡萄胎（P＜0.05）,侵蝕性葡萄胎的表達量低于絨毛膜癌，但差異無顯著意義（P＞0.05）。見"表1,"

表1 正常早孕絨毛和GTD組織中PTTG的蛋白表達

組別例數 PTTG的蛋白表達

－ ＋ ＋＋＋＋＋ 陽性率（％）

正常早孕絨毛 21 182 1014.3%

葡萄胎 25 191 3224.0%

侵蝕性葡萄胎 1432 2778.6%

絨毛膜癌 1531 3880.0%

2．2 C-myc的蛋白表達

2．2．1 C-myc蛋白免疫組化定位：

C-myc蛋白在滋養(yǎng)層細胞和合體滋養(yǎng)細胞都有陽性表達。在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌組織中，C-myc蛋白主要表達于細胞漿，偶爾表達于細胞核。

2．2．2 C-myc蛋白表達半定量分析：

C-myc蛋白在正常早孕絨毛、葡萄胎、侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌的陽性表達率分別為23.5%、 35.0%、71.4%、73.3%。正常早孕絨毛和葡萄胎相比較，C-myc的表達量的差異無顯著意義（P＞0.05）；葡萄胎和侵蝕性葡萄胎相比較，C-myc的表達量的差異有顯著意義（P＜0.05﹚；侵蝕性葡萄胎和絨毛膜癌相比較，C-myc的表達量的差異無顯著意義（P＞0.05）。見表2。

表2 正常早孕絨毛和GTD組織中C-myc的蛋白表達

組別例數 C-myc的蛋白表達

－ ＋ ＋＋＋＋＋ 陽性率（％）

正常早孕絨毛 2117 2 2023.5%

葡萄胎 2518 3 31 35.0%

侵蝕性葡萄胎 1442 35 71.4%

絨毛膜癌 1542 36 73.3%

2.3 GTD中PTTG 與C-myc蛋白表達的相關性：

55例GTD病例中，PTTG和C-myc蛋白表達同時為陽性者為32例，同時為陰性者為10例，表達的一致率為76.4％,呈明顯正相關（R＝0.724, F=49.663,P＜0.05﹚。見表3。

表3 GTD中PTTG蛋白和C-myc蛋白表達的相關性

PTTG蛋白C-myc蛋白

陽性 陰性 合計

陽性32739

陰性 6 1016

合計48 1755

3 討論

人類的hPTTG基因定位于五號染色體的5q33.1。hPTTG cDNA序列由787bp組成，含一個609bp的開放讀碼框架。編碼一條含202個氨基酸的蛋白質,其編碼的蛋白在N末端（58～101）和C末端分別有一富含堿基和一富含脯氨酸的區(qū)域，前者被認為是一核定位信號區(qū)，而后者包含兩個PXXP基序，其作為SH3的結合位點參與SH3介導的信號轉導途徑[2,3]。研究已證明PXXP基序是PTTG在體內多種作用的關鍵位點[4]。

PTTG家族至少有三個成員，PTTG1定位于5q35.1，而PTTG2，PTTG3分別定位于4p15.1和8q13.1，但與前者不同是它們均不含內顯子。Chen等人發(fā)現hPTTG2和hPTTG3的cDNA核酸序列與hPTTG1分別有91%和89%的相似性[5]。

hPTTG的mRNA在正常人類睪丸組織胎兒肝組織胸腺有高表達, 而小腸，結腸，胰腺，大腦，肺，胎盤組織中僅有弱表達，其它人類正常組織hPTTG的mRNA表達幾乎沒有或很低。hPTTG mRNA高表達于垂體，腎上腺，卵巢，子宮內膜，子宮體，肝臟和腎臟等的腫瘤組織中，同時在許多腫瘤細胞系中也有高表達，包括宮頸癌Hela株，絨毛膜癌JEG-3和JAR株，乳腺癌MCF-7，骨源性肉瘤 U-2 OS，肝細胞癌Hep 3B，肺癌 EY，甲狀腺癌TC-1[2.3]。在腫瘤細胞株中高表達的hPTTG99%為hPTTG1，hPTTG2僅在三種腫瘤細胞株中有增高，而hPTTG3的表達僅限于腫瘤組織和腫瘤細胞株[6、7]。這些表明不同的hPTTG家族成員在正常細胞和腫瘤形成中起不同的作用。本實驗中，PTTG蛋白的表達隨著妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的惡性程度增高而增加，說明PTTG與妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤有著密切的關系。

C-myc基因是最早于禽類骨髓瘤病毒MC29中發(fā)現的一種癌基因[8]。C-myc可誘導細胞周期促進細胞增殖、抑制細胞分化和誘導細胞凋亡[9]。本實驗中，C-myc蛋白的表達隨著妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的惡性程度增高而增加，說明C-myc與妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤有著密切的關系。

近年以來，隨著基因和分子生物技術的不斷發(fā)展，人們已經意識到惡性腫瘤的形成和發(fā)展是多基因參與、多步驟的過程。越來越多的腫瘤相關因子被人們發(fā)現，并進行了深入的研究，但在眾多腫瘤因子中，找出腫瘤發(fā)展各個環(huán)節(jié)的重要因子就具有非常重要的現實意義，將有助于對某種類型的腫瘤進行檢測，并將指標量化，從而對腫瘤的診斷、鑒別診斷、預后判斷及個體化治療的選擇等方面提供有意義的參考。PTTG可調節(jié)細胞有絲分裂，刺激成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達和分泌[10]，促進腫瘤血管形成[6]，通過p53依賴和p53非依賴的方式調節(jié)細胞調亡[11]，與C-myc一起作用調節(jié)細胞增殖[12]。本實驗中，PTTG及C-myc蛋白的表達呈明顯正相關性，提示PTTG和C-myc的表達上調可能是滋養(yǎng)細胞惡性轉化的早期事件，并在GTD的惡化進展中起重要作用。因此，PTTG和C-myc表達水平的檢測可作為葡萄胎惡變預測的參考指標?；蜣D錄異?？赡苁荘TTG和C-myc表達上調的主要原因之一，對它們的深入研究有望在妊娠滋養(yǎng)細胞疾病的發(fā)生機制研究領域獲得新的進展。

參考文獻

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